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神经鞘素2（Neuropilin2,NRP2）是一种多功能受体,在神经、心血管和免疫系统等发育中起着重要作用。NRP2在成年正常组织低表达或不表达,而在多种肿瘤细胞膜上如结肠癌、乳腺癌和胶质瘤等高表达。NRP2可与VEGFR等共受体,参与肿瘤新生血管和淋巴管形成,也参与肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭等生物功能的调控。由于NRP2在多种肿瘤细胞膜上高表达并参与肿瘤细胞生物学特性的调控,NRP2已被认为是肿瘤细胞的一个良好生物标志物和分子靶向的治疗靶标。利用单克隆技术制备抗NRP2功能性抗体,发展靶向NRP2的抗肿瘤治疗是一种新颖的策略。不同结肠癌细胞表达NRP2蛋白水平不同,NRP2对不同肿瘤细胞生物活性的调控作用及其参与的分子机制也不尽相同。至今,有关抗NRP2抗体对不同结肠癌细胞株生物活性的影响和分子机制尚未阐明。本研究的目的是检测我们实验室制备的抗NRP2-b1b2单克隆抗体（Anti NRP2 mAB）对结肠癌细胞株的抗肿瘤活性并研究其分子机制,为发展靶向NRP2的抗体药物提供基础参数和研究思路。实验方法:利用小鼠腹水生产抗体,腹水抗体用protein A柱纯化,SDS-PAGE电泳纯度抗体鉴定,ELISA测定抗体活性滴度,WB与免疫组织化学染色鉴定抗体反应特性,显微镜观察抗体对结肠癌细胞形态学的影响,CCK8法检测抗体对不同结肠癌细胞株的生存能力的影响,细胞集落形成实验观测抗体对结肠癌细胞生长抑制作用,流式细胞仪和AnnexinV-PI染色法观测抗体诱导细胞凋亡,迁移实验与Transwell实验检测抗体对肿瘤迁移与侵袭的影响,CRISPER技术建立Nrp-2敲低结肠癌细胞株,JC-1染色法检测抗体对线粒体膜电位的影响,western blot检测凋亡信号分子和EMT指标蛋白水平变化,H2-DCFDA探针检测ROS产生水平,细胞免疫荧光法检测细胞色素C、COX IV分布和EMT关键分子表达,SW480和SW620异种移植小鼠模型来评估抗体对肿瘤生长的影响。结果:SDS-PAGE电泳实验结果表明经protein A柱纯化的Anti NRP2 mAB纯度高,杂蛋白少;ELISA测定抗体活性滴度达1:105以上,免疫组织化学染色鉴定Anti NRP2 mAB有较好反应特异性,对75份正常和103份结肠癌组织样本的免疫组织化学染色分析,结果表明NRP2在结肠癌组织高表达,在癌旁组织也有较高表达,正常结肠组织不表达。显微镜观察显示Anti NRP2 mAB可以引起SW480,SW620,HT29和Lovo细胞株生长形态显著变化,Anti NRP2 mAB处理的结肠癌细胞变圆、脱落和死亡。CCK8 实验结果显示 Anti NRP2 mAB 显著抑制 SW480,SW620,HT29 and Lovo细胞株生长,并呈量效和时效关系,集落形成实验结果显示在低剂量组Anti NRP2 mAB抑制肿瘤细胞集落形成,而在200μg/ml高剂量组,SW480和SW620结肠癌细胞的集落形成完全抑制。流式细胞术和AnnexinV-PI染色结果证明Anti-NRP2 mAB可以明显诱导SW480和SW620细胞凋亡。迁移实验与Transwell实验结果显示Anti NRP2 mAB可以显著抑制SW480和SW620细胞的迁移和侵袭。JC-1染色法实验显示Anti NRP2 mAB可以引起SW480和SW620细胞线粒体膜电位下降,H2-DCFDA探针检测结果显示Anti-NRP2 mAB可以引起SW480和SW620细胞ROS产生升高,细胞免疫荧光和western blot实验结果显示Anti-NRP2 mAB可以引起SW480和SW620细胞的细胞色素C在细胞质分布增加,western blot实验结果显示Anti NRP2 mAB可以上调caspase-3/9和Bax蛋白表达水平,但Caspase 8蛋白水平未见明显变化。在SW SW620细胞株,同时观察到Anti NRP2 mAB下调Bcl-2蛋白表达。EMT蛋白指标检测结果显示Anti NRP2 mAB上调SW620细胞株E-cadherin表达,下调vimentin and N-cadherin表达;与Nrp-2敲低的SW620细胞株的结果相似。但在SW480细胞株,结果显示Anti NRP2 mAB处理后,N-cadherin和vimentin表达明显上调,同时E-cadherin也轻微上调。体内治疗实验结果显示Anti NRP2 mAB对异种移植小鼠模型SW480和SW620肿瘤生长有显著的抑制作用,并呈量效关系。综上所述,这些结果表明,Anti NRP2 mAB对结肠癌细胞株SW480和SW620增殖、迁移、侵袭和EMT有显著抑制作用;Anti-NRP2 mAB对结肠癌细胞增殖的抑制作用可能部分与其诱导通过caspase-9/细胞色素c介导的细胞凋亡有关;在SW620细胞株,Anti NRP2 mAB对EMT的抑制与其上调E-cadherin和下调vimentin和N-cadherin表达有关。在SW480细胞株,Anti NRP2 mAB对EMT的抑制与其上调E-cadherin表达有关。移植瘤动物模型治疗实验进证实,Anti NRP2 mAB对结肠癌细胞株SW480和SW620移植瘤的生长有显著的抑制作用,表明Anti NRP2InAB是一个很有应用前景的候选治疗抗体。