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短支链脂肪酸是一种重要的多功能平台化合物,广泛应用于制造、食品、制药和农业等领域。化学法合成短支链脂肪酸高度依赖于石化产品,反应剧烈,而且得到的有毒副产物难分离,易对环境造成污染,不符合绿色可持续的发展理念。与化学合成法相比,微生物发酵法生产短支链脂肪酸具有原料可再生、反应温和、环境友好和产品易提取等优势。但是,目前报道合成短支链脂肪酸的微生物产量处于较低水平,限制了短支链脂肪酸的工业化生产和实际应用。本研究分为两部分,第一部分的研究目的是从废弃原料豆渣和粗甘油中实现地衣芽胞杆菌短支链脂肪酸的高水平生产,首先通过基因手段过表达了地衣芽胞杆菌短支链脂肪酸合成基因,获得重组菌株;其次优化了重组菌株利用粗甘油和豆渣作为原料产短支链脂肪酸的发酵工艺;最后在此工艺条件下进行了 5 L发酵罐水平分析,实现了短支链脂肪酸的高水平生产;第二部分的研究目的是通过代谢工程改造增强地衣芽胞杆菌从“头”合成短支链脂肪酸的能力,首先强化地衣芽胞杆菌短支链脂肪酸生物合成途径,提高短支链脂肪酸产量,同时引入异源短支链脂肪酸合成途径,最后通过组合代谢工程育种获得短支链脂肪酸高产菌株,进一步提高短支链脂肪酸产量。第一部分研究的主要结论如下:1、首先筛选了四个强启动子（P43、PbacA、PsrfA、PalsSD）对地衣芽胞DWc9n*基因簇bkd自身的启动子进行了替换,过表达了短支链脂肪酸合成基因,得到4 个启动子替换菌株,分别为 DWc9n*-P43bkd、DWc9n*-PbacAbkd、DWc9n*-PsrfAbkd、DWc9n*-PalsSDbkd,在初始培养基条件下,菌株 DWc9n*-PbacAbkd利用粗甘油和豆渣这两种废弃原料作为底物产生的短支链脂肪酸浓度最高,为4.68g/L,与野生型菌株（1.57g/L）相比增加了 1.98倍;其次通过单因素实验和正交实验,对地衣芽胞杆菌DWc9n*-PbacAbkd合成SBCFAs的发酵工艺进行优化,优化后的最佳培养基组成为:甘油60 g/L、豆渣 80 g/L、CaCO3 6 g/L、ZnSO4 0.3 g/L、（NH4）2SO4 1 g/L。在优化条件下,SBCFAs产量进一步增加至7.85 g/L,与初始培养基条件下的野生型菌株（1.57g/L）相比增加了 4.00倍;最后在5 L发酵罐中,采用优化后的发酵培养基考察了菌株DWc9n*-PbacAbkd分别在纯甘油和粗甘油条件下分批发酵产SBCFAs的动态变化,在5 L发酵罐分批发酵过程中,地衣芽胞杆菌DWc9n*-PbacAbkd合成的SBCFAs浓度达到8.37 g/L,生产率达到0.20 g/L/h,这是基于低价值底物发酵产SBCFAs的最高水平。第二部分研究的主要结论如下:2、为了增强地衣芽胞杆菌从“头”合成短支链脂肪酸的能力,以获得的重组菌株DWc9n*-PbacAbkd（DW2-SA1）为研究对象,首先通过启动子替换过表达了SBCFAs合成前体支链α-酮酸的生物合成途径,分别用强启动子PbacA替换ilvC-leu基因簇和ilvD基因的启动子,构建了单独的启动子替换菌株DW2-SA2、DW2-SA3和双启动子替换菌株DW2-SA4,结果表明,单启动子替换菌株和双启动子替换菌株均能提高短支链脂肪酸产量,双启动子替换菌株DW2-SA4产量为4.41 g/L,相比原始菌株DW2-SA1（2.89 g/L）短支链脂肪酸产量提高了46.9%;其次,为了进一步提高短支链脂肪酸的产量,在菌株DW2-SA4基础上敲除了副产物乙偶姻合成途径基因alsD,构建了菌株DW2-SA5,短支链脂肪酸产量为4.95 g/L,比DW2-SA4提高了12.2%,提高幅度不是很大,而且缺失基因alsD后菌体生物量降低,推测菌体生物量对地衣芽胞杆菌发酵产短支链脂肪酸有着很大的影响,这可能是限制SBCFAs进一步增加的原因;为了实现地衣芽胞杆菌短支链脂肪酸的异源合成,引入了来源于乳酸乳球菌的酮酸脱羧酶基因kivD,构建了地衣芽胞杆菌短支链脂肪酸异源合成菌株DWc9n*/pHY-P43kivD,产量为3.23 g/L,实现了短支链脂肪酸的异源合成;另外还构建了不同位点突变的酮酸脱羧酶表达菌株DWc9n*/pHY-kivDS268T、DWc9n*/pHY-kivDV461I、DWc9n*/pHY-kivDF381W、DWc9n*/pHY-kivDM538W,效果最好的酮酸脱羧酶突变菌株为DWc9n*/pHY-kivDF381W,短支链脂肪酸产量为4.23 g/L,比菌株DWc9n*/pHY-P43kivD提高了 30.9%,实现了异源合成短支链脂肪酸的进一步提高;最后,通过组合代谢工程构建了重组菌株DW2-SA5/pHY-kivDF381W,短支链脂肪酸产量达到7.85 g/L,比DW2-SA5/pHY300PLK提高了 60.5%,内源和外源合成途径的组合进一步提高了短支链脂肪酸产量,这说明通过代谢工程改造地衣芽胞杆菌从“头”合成短支链脂肪酸的能力得到增强。