目的:基于正交设计实验,通过观察高浓度糖皮质激素(地塞米松)对斑马鱼骨骼矿化及成骨细胞分化的影响,筛选并探析牛膝-杜仲药对活性成分最佳组合的干预作用;通过观察地塞米松诱导斑马鱼氧化应激相关信号转导分子的异常变化及活性成分组合的纠正作用,探讨β蜕皮甾酮-松脂醇二葡萄糖苷组合干预糖皮质激素性骨质疏松模型的部分分子机制。为β蜕皮甾酮-松脂醇二葡萄糖苷组合防治糖皮质激素性骨质疏松症提供实验依据。方法:1.选用5dpf WT型斑马鱼,分为对照组及不同浓度地塞米松(Dex)高、中、低浓度(10、1、0.1μM)造模组,药物作用96h,茜素红染色分析斑马鱼幼鱼脊柱部位骨面积(Area)及总光亮度(Sum Brightness)。2.在模型建立的基础上,以不同浓度(10、1、0.1μM)阳性对照药物阿仑膦酸钠(ALN)、牛膝活性成分β蜕皮甾酮(βEcd)、杜仲主要活性成分松脂醇二葡萄糖苷(PDG)、绿原酸(CGA)、京尼平苷酸(GA)、桃叶珊瑚苷(AU)干预GIOP斑马鱼模型96h,进行茜素红染色,体视显微镜下拍照观察并统计斑马鱼脊椎骨的面积(Area)和累积光亮度(Sum Brightness),得出各活性成分干预模型的最适浓度。3.应用正交设计实验方法,在GIOP斑马鱼模型的基础上,以βEcd为加载因素,以PDG、CGA、GA、AU为影响因素,通过茜素红染色方法及碱性磷酸酶(ALP)活性检测,筛选出牛膝-杜仲活性成分的最佳组合。4.基于正交设计实验结果,通过检测ALP活性、Western-blot实验检测氧化应激相关信号转导分子Ask1、JNK、Akt、FOXO3a蛋白及其磷酸化表达变化,及凋亡相关因子Bax、抗凋亡因子Bcl-2表达变化,观察杜仲最佳活性成分PDG、牛膝-杜仲最佳活性成分组合βEcd-PDG对上述因子异常变化的纠正作用。结果:1.10μM Dex可显著降低斑马鱼脊椎骨面积和骨密度,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.10μM、1μM浓度的牛膝活性成分βEcd、杜仲主要活性成分PDG、CGA、GA、AU均能有效改善10μM Dex引起的斑马鱼脊椎部位Area、Sum Brightness的降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.应用正交设计统计方法,对模型骨骼茜素红染色的Area、Sum Brightness结果进行方差分析,并对模型进行ALP活性检测,并对检测结果行方差分析,得出βEcd与PDG为最佳组合,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.ALP测定结果显示:10、1μM杜仲最佳活性成分PDG及活性成分组合βEcd-PDG(浓度各1μM)可增强ALP活性,差异具有统计学意义(P<0.05)。βEcd-PDG增强效果优于PDG。5.Western Blot检测结果显示:10μM Dex升高P-Ask1、JNK的表达,降低PAkt-473、P-FOXO3a、P-JNK的表达,并且升高凋亡因子Bax、降低抗凋亡因子Bcl-2表达,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,1μM PDG降低JNK的表达,升高P-Akt-473、P-FOXO3a、P-JNK的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,βEcd-PDG降低P-Ask1、Bax、Caspase3的表达,升高P-FOXO3a、P-JNK的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.牛膝活性成分βEcd、杜仲主要活性成分PDG、CGA、GA、AU可抑制Dex引起的GIOP斑马鱼模型脊椎骨量减少,并提高脊椎骨密度。2.正交设计法筛选出βEcd-PDG(牛膝、杜仲活性成分)组合为干预GIOP斑马鱼模型最有效的组合。3.Dex降低ALP活性,而PDG、βEcd-PDG组合抑制Dex引起的ALP活性降低,且βEcd-PDG抑制效果优于PDG。4.高浓度Dex作用条件下,激活斑马鱼模型的氧化应激信号通路。βEcd-PDG组合通过抑制氧化应激、抑制细胞凋亡来干预GIOP并促进骨形成,且效果优于PDG。