论文部分内容阅读
稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起水稻病害稻瘟病,稻瘟病的发生,严重影响了水稻产量和品质,造成严重损失。稻瘟病菌作为研究植物病原真菌致病机制的模式生物,在病害发生过程中,有大量参与调控的基因,涉及分生孢子萌发、附着胞形成及甘油合成等。因此对其相关基因及致病机理的研究可作为防治稻瘟病的重要理论依据。过氧化物酶体(peroxisomes)是真核细胞中重要的细胞器,参与乙醛酸循环、脂肪酸β-氧化及活性氧的调节等生化代谢过程,过氧化物酶体基质蛋白在细胞质中合成,依靠自身的位信号PTS而被转运系统识别。Pex5和Pex7分别是PTS1和PTS2的受体。PTS被受体Pex5和Pex7识别后,受体复合物在对接复合体(Pex13,Pex14和Pex17)的作用下将基质蛋白转运至过氧化物酶体内部。然后Pex5和Pex7通过泛素系统返回细胞质,进行下一轮的循环。已有研究认为,Pex4编码的泛素结合酶及其锚定蛋白Pex22参与Pex5和Pex7的泛素化及再循环过程,从而影响过氧化物酶体形成。缺乏Pex4和Pex22,细胞特征不具有典型的过氧化物酶体,并且影响过氧化物酶体基质蛋白的定位。前期工作中,我们对稻瘟病菌MoPEK4和MoPEX22基因分别进行了敲除,并分析了突变体的表型,结果显示MoPEK4和MoPEX22基因缺失均对稻瘟病菌的生长发育及致病性有影响。为深入研究MoPEK4和MoPEX22在过氧化物酶体形成及稻瘟病菌在生长发育过程中的功能及相互关系,本实验通过基因双敲除对MoPEK4和MoPEK22单敲突变体和双敲突变体的表型进行了对比分析,并通过基因表达量分析对MoPEX4和MoPEK22的相互关系进行了探究。结果如下:通过农杆菌介导转化(AtMT)将含有潮霉素(HpH)抗性基因的敲除载体pKO-MoPex4导入稻瘟病菌的△Mopex22(氯嘧磺隆抗性)突变体菌株中,经过验证获得双敲突变体AMopex4/pex22。在此基础上我们通过实时荧光定量PCR扩增显示,MoPEX22基因缺失提高了MoPEK4基因在△Mopex22菌株中的表达量,MoPEX4基因缺失提高了MoPEK22基因在△Mopex4菌株中的表达量;通过荧光蛋白定位检测过氧化物酶体基质蛋白的定位情况发现,MoPEK4、MoPEX22及双敲基因缺失均影响了 PTS1与PTS2在过氧化物酶体上的定位;将构建好的mCherry-Hexl融合蛋白载体导入野生型与突变体发现,MoPEX4、MoPEK22和双敲基因缺失均影响了伏鲁宁体蛋白Hexl的定位;将构建好的GFP-MoPex5融合蛋白载体导入野生型与突变体发现,MoPEX4、MoPEK22和双敲基因缺失没有影响MoPEK5的定位;在CM培养基上培养7d发现,与野生型Guy-11相比,MoPEK4、MoPEK22和双敲基因缺失致使稻瘟病菌的生长速率及产孢量下降,且双敲基因缺失后下降最严重;通过黑色素产量测定,结果表明MoPEX4、MoPEK22和双敲基因敲除后均致使黑色素产量明显下降,且双敲基因敲除后黑色素产量下降最显著;通过测定在大麦和水稻上的致病性发现,MoPEK4、MoPEK22和双敲基因参与稻瘟病菌的致病过程,基因缺失后将会导致稻瘟病菌致病力显著下降;MoPEK4、MoPEK22和双敲基因参与稻瘟病菌的孢子萌发、附着孢形成及附着胞膨压积累的过程,基因缺失后将会导致稻瘟病菌的孢子萌发率及附着胞形成率严重下降;在含有 200 μg/mL Congo red、100 μg/ml Calcoflour white 的 CM 培养基上培养 7 d 发现,MoPEX4、MoPEK22和双敲基因对维持稻瘟病菌的细胞壁完整性有着重要的作用,且MoPEX22基因缺失影响最大;在含有5mM H2O2、1mM Methyl viologen的CM培养基上培养7 d发现,MoPEK4、MoPEK22和双敲基因会减弱稻瘟病菌的活性氧的耐受性,且双敲基因缺失影响最大。