Ⅰ两个抑癌新基因PP5715和PP1195的研究;Ⅱ干扰素-β(IFN-β)的改造

来源 :中国科学院上海药物研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:aixuexier
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  本论文的第一部分是对两个抑癌新基因PP5715和PP1195的研究,这两个基因是在大规模cDNA转染筛选与肿瘤发生发展相关基因的实验中首先发现的。在大肠杆菌中表达了PP5715蛋白,主要以包涵体的形式存在,对其进行了亲和纯化及复性研究。重组PP5715蛋白对肝癌细胞SMMC7721和HepG2的生长有一定抑制作用。在甲醇酵母中表达了PP5715蛋白,蛋白粗提液对肝癌细胞HepG2具有一定的生长抑制作用。将PP5715与GFP融合后,确定了PP5715蛋白是分泌蛋白。对比野生型PP5175基因,发现肝癌细胞SMMC7721和HepG2中的PP5715基因存在错义突变,提示可能与其癌变机制有关。PP1195基因在肝癌细胞SMMC7721和HepG2中的过表达可以抑制其生长;利用RNA干扰技术,使其在正常肝细胞HL7702中的表达沉默后,可以加速细胞生长,表明PP1195可能是一个新的抑癌基因。在甲醇酵母中表达了PP1195蛋白,蛋白粗提液对肝癌细胞HepG2具有一定的生长抑制作用。将PP1195与GFP融合后,确定PP1195蛋白亚细胞定位于细胞核外。应用多克隆抗体,通过对噬菌体展示肽库的淘筛,模拟了PP1195的抗原表位。   本论文的第二部分是对IFN-β的改造。在大肠杆菌中表达纯化了IFN-β,对其抗SARS病毒活性进行了分析,并研制了以其为主要成分的鼻腔喷雾剂。利用定点突变技术,将野生型IFN-β第17位半胱氨酸突变为丝氨酸,得到高稳定性高活性的突变体IFN-β1b。在大肠杆菌中IFN-β1b实现了高表达,研究了重组IFN-β1b的纯化工艺,为大规模生产打下了基础。将IFN-β1b与IFN-α2b融合成新型干扰素IFN-BLA,在大肠杆菌中优化了其表达条件,纯化了重组蛋白。抗病毒活性测定表明,IFN-BLA具有协同的或加成的抗病毒活性。   
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