植物类受体蛋白激酶(Receptor-like protein kinases,RLKs)是植物最大的一类蛋白家族,结合其配体,参与了植物生长发育的所有过程。目前只有少数的RLKs配体被发现,大部分RLKs的配体及其行使的功能和作用形式都还不清楚。研究RLKs及其相应配体,对植物信号通路的研究具有重要意义。表面等离子共振(Surface plasmon resonance,SPR)是一种发生在金属薄膜表面的基于光的全反射的物理现象。基于周期性金属纳米结构的表面等离子体传感器由于其独特的异常透射(Extraordinary optical transmission,EOT)效应,具有检测装置简单、操作便捷等优势,在医疗诊断和药物筛选等领域得到广泛应用。生物分子在传感器表面的固定效率是影响传感器性能的主要因素之一,对传感器在生物分子检测中的应用起着非常重要的作用。本课题利用不同的修饰基质对周期性纳米结构SPR传感芯片表面进行功能化修饰,研究不同修饰剂、修饰剂官能团浓度等对蛋白质固定效率的影响。选择最优蛋白质固定策略,并在类受体蛋白激酶的检测中进行初步应用。主要研究结果如下:1.传感芯片表面蛋白质固定效率的研究。首先,利用巯基十一酸(11-mercaptoundecanoic acid,MUA)和巯基聚乙二醇羧基(Sulfhydryl polyethylene glycol carboxyl,SH-PEG-COOH)对传感芯片表面进行自组装修饰使芯片表面羧基化,并固定IgG蛋白进行芯片表面的抗蛋白非特异性吸附研究。用EDC和NHS活化后的芯片固定蛋白作为实验组,吸附对照组不进行活化处理,检测透射光谱中SPR峰位的变化,结果发现相对于MUA修饰的芯片,PEG修饰的芯片具有更好的抗蛋白非特异性吸附效果;在PEG系列修饰的芯片中,随着烷基链的增长,芯片表面的抗蛋白非特异性吸附能力也逐渐增强,但固定效率有所降低。其次,研究修饰剂官能团浓度对于固定效率的影响。用长链SH-PEG-COOH和短链SH-PEG-OH在芯片表面制备自组装混合膜。SH-PEG-COOH/SH-PEG-OH 的比例分别为 1:9、1:6、1:3、1:1、3:1、6:1、9:1。结果发现,混合自组装膜羧基与羟基比例为1:6时,固定蛋白后透射光谱SPR峰位的移动最大。用X射线能谱(Energy dispersive spectrometer,EDS)对芯片表面进行元素分析,结果表明,比例为1:6时,芯片表面的N元素含量最高。同时,利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)和带有链霉亲和素的聚苯乙烯(Polystyrene,PS)微球进行辅证。固定GFP蛋白,用激光共聚焦显微镜观察芯片表面荧光蛋白的分布情况,在比例为1:6时,芯片表面荧光蛋白分布最多;固定PS微球,扫描电镜结果显示,在比例为1:6时,表面微球分布最密集。以上实验结果表明,PEG混合自组装膜羧基与羟基比例为1:6时,蛋白固定效率最高。对于MUA和PEG在传感芯片上形成的二维修饰基质,MUA修饰的芯片蛋白固定效率高但抗蛋白非特异性吸附能力差,PEG修饰的芯片表面抗蛋白非特异性吸附效果好,但固定效率相对较低。因此在PEG修饰的二维基质的基础上,进一步修饰上α-环糊精,形成表面三维修饰基质,进行芯片表面的抗蛋白非特异性吸附研究。实验结果表明,三维修饰基质在固定效率和抗蛋白非特异性吸附效果上均优于二维修饰基质。2.利用原核表达系统对类受体蛋白激酶胞外域进行表达。为了研究本课题的纳米SPR传感器在RLKs检测中的应用,选择一对已知的受体-配体(FLS2和flg22)作为研究对象。有研究证明,类受体蛋白激酶与配体结合的部位在其胞外域,所以本课题选择了对 FLS2 的胞外域(24-806 AA),FER 的胞外域(28-446 AA)以及 RALF 的 72-120 AA进行蛋白表达。尝试构建了带His标签和GST标签的载体来进行蛋白的诱导表达,但均表达不出目的蛋白。通过对FER和FLS2氨基酸序列进行分析发现,这些蛋白的胞外域有大量的疏水氨基酸,因此,选择带有助溶标签MBP和SUMO的pSmart系列载体进行蛋白表达。最终成功地表达出目的蛋白,并对其进行纯化浓缩,蛋白浓度达到毫克级别。3.环糊精(Cyclodextrin,CD)修饰的纳米SPR传感芯片在RLKs检测中的应用。在纳米SPR传感芯片表面固定小肽flg22,与FLS2反应后,传感芯片透射光谱SPR峰位发生了约3.5 nm的移动。而固定小肽RALF与FLS2反应的对照组则没有检测到SPR峰位明显的移动。在另一组对照实验中,用FER取代FLS2与固定flg22的传感芯片表面进行反应,结果同样没有观测到SPR峰位的移动。以上实验结果表明,环糊精修饰的纳米等离子体传感芯片可以用来检测类受体蛋白激酶与其配体的结合,且具有较好的特异性。