论文部分内容阅读
第一部分:西洋参皂甙通过调节内质网应激修复神经功能目的:脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)后可残留严重的神经功能障碍。迄今为止,尚无直接有效的治疗方法。其中促进轴突再生和恢复丢失脊髓损伤后神经功能这两个方向就是目前最理想的治疗方案。许多文献报道内质网应激在神经退行性疾病中的作用,后者可影响神经元并调节其功能。然而,内质网在急性创伤性脊髓损伤的直接作用中具体未知。西洋参皂甙(PQS)是西洋参的主要有效组分,具有抗炎和抗凋亡的作用,尤其是在心肌细胞中。然而,PQS对急性创伤性SCI的病理过程的潜在影响尚不清楚。本研究是从内质网应激的角度来探索PQS对受损脊髓的修护和保护作用,二是证明其通过调节内质网应激的作用来影响细胞凋亡水平和促进轴突修复。通过本次研究,我们将对PQS在脊髓损伤中的作用及其机制的产生能有更进一步地认识,同时为临床上治疗脊髓损伤提供有意义的基础依据,也为指导脊髓损伤提供新的角度。方法:分为两个方向:动物实验和细胞实验。体内实验:将SPF级雌性Sprague-Dawley大鼠分为3组:假手术组、SCI模型组、SCI+PQS给药组。采用HE染色,尼氏染色这两种染色方法来评价连续给药28天后脊髓的保护和修复作用。检测假手术组,SCI模型组、SCI+PQS给药组1,3,5,7,14,21,28天的BBB评分和斜面测验评价运动功能用于评价各组大鼠脊髓损伤的神经功能恢复情况。为了验证PQS能否影响凋亡水平,我们用蛋白免疫印迹检测Cleaved-caspase3,Bax和Bcl-2等凋亡蛋白表达情况。同样采用western blot检测微管蛋白Acetyl-α-tubulin的表达情况。用TUNEL法检测7天后各组脊髓组织的凋亡细胞数量来评估在脊髓损伤的神经细胞丢失程度。为了模拟细胞内质网应激模型,将PC12细胞分组为:正常组、TG组、TG+PQS(50ng/ml)组、TG+PQS(150ng/ml)组、PQS(150ng/ml)组。同样我们利用western blot,免疫荧光,TUNEL法在细胞水平上检测了凋亡水平,微管蛋白水平。用western blot方法检测脊髓损伤1天后GRP78、PDI水平,以及CHOP和Cleaved-caspase12等凋亡因子蛋白的表达情况,包括体外实验。结果:在本课题中,我们发现PQS给药后能减轻脊髓损伤后结构损伤,促进脊髓损伤后神经功能的恢复。体内以及体外实验免疫印迹和免疫荧光的结果都表明PQS对急性创伤性脊髓损伤后的细胞凋亡具有抑制作用。且脊髓损伤后内质网应激水平明显升高,而PQS能有效地改善急性脊髓损伤后内质网应激,以及相关的细胞凋亡水平。实验中还发现组织内Acetyl-α-tubulin微管蛋白在经过PQS治疗之后其蛋白丢失也明显缓解。结论:本实验第一次证明急性创伤性脊髓损伤后,PQS能够通过调节内质网应激来抗细胞凋亡和修复轴突的作用来减少脊髓组织的损伤,从而有助于脊髓的恢复。我们的研究结果显示,急性创伤性脊髓损伤后,给予PQS治疗后明显改善了脊髓损伤且有助于脊髓组织的恢复。这就说明了抑制内质网应激以及其相关的凋亡为治疗急性创伤性脊髓损伤提供了新的角度,也就意味着PQS很有可能是治疗急性创伤性脊髓损伤的新型药物。而这机制的发现也就为我们临床治疗脊髓损伤上指导临床用药提供非常重要的依据。第二部分:西洋参皂甙通过调节TLR4/NFκB通路减少组织炎症目的:炎症反应是影响脊髓损伤难以愈合的另外一个重要机制。成年中枢神经系统受损神经元的神经突起在炎症环境中很少能自发修复。神经炎症通常被认为是影响神经功能恢复的有害因素,可引起前角运动神经元的进行性损伤。前期有文献报道PQS有抑制炎症的作用。然而,PQS对急性创伤性SCI所引起的抑制性环境的作用尚未报道。本研究是一是探索PQS对脊髓损伤后炎症因子表达的影响,二是进一步研究PQS是通过何种信号通路来起作用的。通过本次研究,我们将对PQS在脊髓损伤中的抑制性环境中的作用及其机制有更进一步地认识。方法:分为两个方向:动物实验和细胞实验。体内实验:将SPF级健康雌性Sprague-Dawley大鼠分为3组:假手术组、SCI模型组、SCI+PQS给药组。我们利用蛋白免疫印迹检测脊髓组织内Iba-1、IL-6、TNF-α等炎症蛋白含量的表达情况。体外实验:为了模拟细胞内炎症模型,BV2细胞实验将细胞分组为:正常组、LPS组、LPS+PQS(50ng/ml)组、LPS+PQS(150ng/ml)组、PQS(150ng/ml)组。同样采用蛋白免疫印迹检测五组细胞TLR4、IκB-α、Nuclear P65等炎症通路蛋白的表达情况,检测了 5组细胞炎症因子TNF-α和IL-6的蛋白表达情况。结果:在本课题中,我们发现PQS治疗后,SCI后其炎症因子(Iba-1、IL-6、TNF-α)表达下调,说明PQS明显减少了炎症反应。体外实验表明了 PQS抑制TLR4/NFκB通路来缓解脊髓损伤。结论:本实验第一次证明急性创伤性脊髓损伤后,PQS能够通过调节TLR4/NFκB通路来减少脊髓组织的炎症反应,从而限制脊髓损伤后的抑制性环境。后者可能为减轻轴突损伤以及后期轴突再生创造了条件。