细菌承受着来自入侵者——噬菌体等可移动遗传元件的巨大进化压力。在与噬菌体的长期竞争过程中,细菌等原核生物已经进化出种类丰富的免疫系统来应对噬菌体所带来的侵染威胁,包括先天性免疫系统以及适应性免疫系统。细菌和古细菌中广泛存在着一种适应性免疫系统,被称为CRISPR-Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR Associated）系统,其免疫过程主要分为三步:间隔序列的获取、crRNA的生成以及对外源核酸的干扰。由CRISPR-Cas系统发展而来的基因编辑技术已经成为分子生物学的重要实验方法,在育种、疾病治疗等方面都得到了广泛的应用。然而CRISPR在医学临床上的应用仍然十分受限,主要有两方面的原因:一是由于多种因素干扰,导致系统的编辑效率较低;二是有较高的脱靶风险。因此,基因编辑未来的发展也是以解决这两方面的问题为主,提高编辑效率,避免脱靶效应。针对细菌的这一免疫系统,噬菌体进化出多种手段来对抗CRISPR-Cas系统,其中一种高效的抑制机制是通过编码AntiCRISPR蛋白（Acrs）使CRISPR-Cas系统失活。目前已经鉴定出90余种Anti-CRISPR蛋白,这些Acr蛋白通过抑制CRISPR-Cas系统作用过程的不同阶段来发挥抑制作用,作用方式主要为抑制CRISPR-Cas系统对外源核酸的结合或切割,因此具有抑制CRISPR-Cas系统脱靶效应的应用潜力。本课题所研究的Acr IF5蛋白,是一种针对I-F型CRISPR-Cas系统的Acr蛋白,于2013年被首次鉴定出。Acr IF5在基因组上通常不能单独存在,而与另一种Anti-CRISPR基因Acr IF3共存。Acr IF3通过与核酸酶Cas2/3结合而抑制CRISPR系统对靶标DNA的酶切,抑制能力较强。Acr IF5的抑制能力较弱,且表现出CRISPRi+的表型,意味着Acr IF5存在的条件下CRISPR效应蛋白复合物仍然可以与靶标DNA结合,且AcrIF5不能直接与效应蛋白复合物Csy（crRNA-guided surveillance）以及核酸酶Cas2/3结合。在本论文研究之前,Acr IF5的作用机制一直未被报道。作者表达纯化了Acr IF5以及I-F型CRISPR-Cas系统的效应蛋白复合物Csy,通过非变性凝胶电泳、Pulldown、分子筛孵育实验确定了Acr IF5可以与Csy-ds DNA复合物结合。作者制备出Csy-ds DNA-Acr IF5复合物样品,通过冷冻电镜技术解析其结构,同时利用X-射线晶体衍射技术解析了Acr IF5的晶体结构。Csy-ds DNA-Acr IF5复合物结构显示Acr IF5形成五聚体结构,与Csy复合物中由Cas7f亚基形成的“腹部”结构形成紧密相互作用。并且,在复合物结构中无法看到Cas8f亚基中的螺旋束（Cas8f-HB）区域的电子密度,而Cas8f亚基这一部分结构直接参与I-F型CRIPSR-Cas系统招募核酸酶Cas2/3。我们发现结合的5个Acr IF5蛋白中,Acr IF5.3/5.4与Csy-ds DNA复合物中的螺旋束区域具有明显的空间位阻。因此,Acr IF5蛋白对I-F型CRISPR-Cas系统的抑制机制,可能是通过与Csy-ds DNA结合,将“锁定”状态的Cas8f-HB变为“自由摆动”状态,影响核酸酶Cas2/3的招募而实现抑制作用。我们通过实验证明了Acr IF5与螺旋束竞争结合Csy-ds DNA复合物,使Csy-ds DNA与Cas2/3的结合受到抑制,最终提出了Acr IF5抑制I-F型CRISPR-Cas系统的作用机制。在以上工作的基础上,我们又对含有Acr IF5基因的32种细菌或噬菌体的基因组进行生物信息学分析,发现Acr IF5基因从不单独存在,而是一直与另一个抗CRISPR蛋白Acr IF3基因所共存。综上所述,我们通过蛋白质结构分析、生化实验分析以及生物信息学分析,首次提出了Acr IF5与Acr IF3发挥协同作用,在Csy-ds DNA对核酸酶Cas2/3的招募途径中,由Acr IF3发挥抑制Cas2/3招募的主要作用,而Acr IF5对Acr IF3的抑制作用进行补充的共同作用模式。Acr IF5具有的这种通过特异性结合Csy-ds DNA复合物,与Acr IF3共同作用,来干扰核酸酶Cas2/3对外源核酸的酶切的方式十分独特,为CRISPR技术应用过程中出现的脱靶效应提供了一种新颖的解决思路。