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鸡马立克氏病(Marek’s disease，MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)引起的鸡的一种高度传染性、淋巴组织增生性疾病。MDV疫苗株是一种良好的病毒载体，以它作为载体构建表达外源抗原的多价活疫苗来诱导免疫，可达到预防一种或多种禽病的目的。MDV血清Ⅰ型(MDV-1)814株是我国分离到的自然弱毒株，长期作为疫苗使用，免疫原性良好。选择其作为病毒载体构建重组病毒，可用于MD及其它禽病的防治，同时也可利用其研究MDV基因功能及肿瘤发生机制。本文利用MDV-1 814疫苗株作为载体，以病毒基因组US10基因区为插入位点，分别插入绿荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因表达盒、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)融合蛋白(Fusion，F)基因表达盒和禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)血凝素(Hemagglutinin，HA)基因表达盒，分别构建了包含NDV F基因、AIV HA基因和GFP基因的重组MDV转移载体质粒，同时获得了一株表达GFP的MDV 814株重组病毒。根据GenBank中已发表的MDV GA株US1-US10-SORF3基因序列，设计两对引物，并于各引物5’端引入酶切位点，以MDV 814株基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物作为同源重组的MDV同源臂。同源臂1的上游引物在US1基因中部，下游引物在US10基因上游，靠近起始密码子；同源臂2的上游引物在US10基因下游，靠近终止密码子，下游引物在SORF3基因中部。将两PCR产物按照预先设计的酶切位点，依次克隆入pUC19载体，构建成重组MDV转移载体质粒pUC-US10。经过与GA株序列比较，证实获得的MDV-1 814株同源臂序列与预期相符合。根据商品化表达质粒pEGFP-N1的序列，在其启动子上游及polyA下游分别设计一条引物，于引物5’端分别引入酶切位点，以质粒载体pEGFP-N1为模板进行PCR扩增，获得GFP基因表达盒，其中包含CMV启动子和SV40 polyA。将此基因表达盒克隆入载体质粒pUC-US10的SphI位点，获得包含GFP基因表达盒的重组MDV转移载体质粒pUC-US10-GFP。根据质粒pEGFP-F(包含NDV F基因表达盒)和pCIHA(包含AIV HA基因表达盒)核苷酸序列分别设计一对引物，PCR扩增其中的NDV F和AIV HA基因表达盒部分，并克隆入质粒pUC-US10的SphI位点，获得转移质粒载体pUC-US10-F和pUC-US10-HA。采用磷酸钙沉淀法，将MDV转移质粒载体pUC-US10-GFP与MDV 814株基因组总DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast，CEF)，经绿色荧光标记筛选，获得表达绿色荧光蛋白的重组MDV 814病毒。PCR鉴定证实GFP基因表达盒正确插入到MDV-1 814株US10基因中。重组病毒在CEF上继代20代后，PCR鉴定可检测到GFP基因，表明重组病毒能够在体外稳定遗传。通过测定重组病毒和亲本病毒的体外生长曲线，证明重组病毒的生长特性与亲本病毒无显著差异。本实验成功构建了表达绿色荧光蛋白的重组MDV 814株，为我国MD疫苗的研究及MDV基因功能的研究奠定基础。同时还构建了包含AIV HA基因和NDV F基因的重组转移载体质粒，在此基础上，可以通过反向筛选的方法获得表达AIV HA蛋白和NDV F蛋白的重组814病毒。AIV HA蛋白和NDV F蛋白都是抗原性非常好的蛋白，用它们构建重组MDV 814株，可以很好的诱导机体的体液免疫，从而达到同时预防几种禽病的目的。