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肿瘤的多药耐药是导致其临床治疗失败的主要原因,肿瘤多药耐药的发生机制复杂,而ATP结合盒式蛋白-过度表达介导的耐药是目前接受最广泛的机制。常见的ATP结合盒式蛋白如P-gp是一类ATP驱动泵,由ATP水解提供能量将药物泵出细胞,使细胞内有效药物浓度降低,最终导致化疗失败。因此,降低P-gp表达或下调ATP是克服多药耐药的有效途径。现有策略例如P-gp小分子抑制剂或siRNA的应用,切断肿瘤细胞能量供应等存在毒性大,起效慢,递送体系成分复杂,制备困难等诸多问题,发展一种简便有效的逆转耐药策略势在必行。研究发现胞内Ca2+异常会影响线粒体呼吸链复合物I,进而影响细胞呼吸,影响胞内氧含量。而P-gp的合成与氧含量密切相关,肿瘤组织乏氧环境会导致HIF-1α异常表达,进而促进P-gp合成。因此,通过抑制细胞呼吸,进而增加胞内氧含量,下调HIF-1α,有望减少P-gp的合成;与此同时,抑制细胞呼吸还伴随着ATP降低,阻断P-gp转运及泵出功能。此外,肿瘤细胞对Ca2+具有较强敏感性,这也为选择性的逆转肿瘤细胞耐药奠定了基础。基于上述分析,本课题拟制备一种简单有效的钙离子纳米发生器通过介导胞内钙离子爆发实现逆转耐药。1.CaP-DOX-RGD纳米体系的制备及体外性质考察。双反相微乳法制备CaP,TEM、ICP-MS结果得知CaP为100 nm的多孔球形结构,在pH 6.8条件下有较弱崩解,Ca2+产生较少;在pH4.5条件下,纳米粒几乎完全崩解,Ca2+产生量约为pH 7.4条件下的11倍。物理方法装载抗肿瘤药物DOX,电位由-15.5 mV增加至-8.4 mV;为提高其分散性及实现肿瘤血管靶向功能,DSPE-PEG2000-RGD对其修饰,所得CaP-DOX-RGD为140 nm的球形结构,DOX装载率约25%;在pH7.4和6.8条件下,DOX的24h释放量不超25%;在pH4.5条件下4h释放量超出60%,表明其在肿瘤微环境较稳定,在溶酶体环境有较佳的释放性能;溶血实验结果表明CaP纳米粒(0-200 μg mL-1)有较好的生物安全性。2.研究CaP-RGD纳米粒在体外逆转MCF-7/ADR细胞耐药的能力。CaP-RGD被MCF-7/ADR内吞后,胞内Ca2+增加呈时间依赖性,且2 h-4 h在溶酶体内分布较多,6h主要分布在线粒体内;线粒体复合体I的活性(由1.00降低至0.06)被CaP-RGD大幅下降,同时胞内ATP(由23.9降低至8.9 nmol/mg)降低。进一步研究细胞内氧含量及下游相关分子的变化,结果表明氧含量大幅上升,缺氧诱导因子降低;多药耐药基因(由1.00降低至0.39)下降;MDR1编码的蛋白P-gp(细胞内及膜上)降低;此外,在CaP-RGD的作用下,细胞膜上仅存的少许P-gp在胞内未能结合充足的ATP,无法发挥泵出功能;CCK-8结果得知,MCF-7/ADR细胞IC50值高达168 μg mL-1,对DOX有较高耐药性(耐药倍数高达 70 倍)。相较于 DOX 作用的 MCF-7/ADR,CaP-DOX-RGD 组的 IC50值(5.7μg mL-1)大幅下降,下降幅度约96%,体外细胞抑制率73%。3.研究CaP-RGD的靶向性及体内逆转MCF-7/ADR耐药的能力。皮下种植MCF-7/ADR至BALB/c裸鼠背部构建耐药肿瘤模型,CaP装载近红外光染料IR 783并修饰DSPE-PEG-RGD,利用活体成像仪观察IR 783荧光强度。尾静脉给药36h,游离IR783组、CaP-DOX-PEG组荧光较弱,而RGD组肿瘤部位荧光较强;50 h后,仅RGD组的肿瘤部位观察到荧光,证实了 RGD的靶向能力。单次尾静脉给药CaP-RGD,研究肿瘤部位Ca2+(由1.0增加至3.4),HIF-1α(由1.000 降低至 0.697),P-gp(由 0.91 降低至 0.74),ATP(由 211 降低至 45nmol/mg)证明了 CaP-RGD具备体内逆转耐药的能力。4.研究CaP-DOX-RGD体内抗耐药肿瘤效率及安全性评价。向荷瘤裸鼠体内尾静脉给药,通过体重,瘤体积,H&E及TUNEL染色等手段评价抗肿瘤作用及体内安全性。裸鼠体重、H&E染色结果表明CaP-DOX-RGD有较好的生物安全性。游离DOX抑瘤率约5.6%,CaP-RGD+DOX组抑瘤率为27.9%,CaP-DOX-RGD 组靶向富集到瘤组织后,胞内产生的大量钙离子通过下调 ATP,降低 P-gp协同逆转耐药,促使胞内DOX累积并发挥抗肿瘤作用,抑瘤率高达92.6%。总之,本课题制备了一种简单有效的钙离子纳米发生器,通过介导胞内钙离子爆发实现逆转耐药。双反相微乳法制备CaP,装载DOX之后,修饰卵磷脂接枝的RGD肽。由于RGD的肿瘤血管靶向功能,该纳米体系可富集到肿瘤组织,进而被肿瘤细胞摄取。在溶酶体酸性环境中,快速崩解并释放大量Ca2+,基于肿瘤细胞对Ca2+的敏感性,它可通过下述机制逆转P-gp介导的多药耐药:Ca2+选择性聚集在线粒体,通过抑制线粒体呼吸链复合体I,抑制细胞呼吸,增加胞内氧含量,下调HIF-1α表达抑制P-gp合成;与此同时,钙离子爆发介导的呼吸抑制,阻断胞内ATP生成,协同阻断P-gp介导的耐药。最终MCF-7/ADR的IC50值降低至5.7 μg mL-1,降低幅度约96%,体外细胞抑制率73%,体内抑瘤率92.6%,这种简单高效、安全的“钙离子爆发”策略具有一定的临床应用潜力。