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研究背景肝缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, I/R)常发生于肝移植、低血容量性和心源性休克以及肝脏肿块和肿瘤的肝叶手术切除中,是肝功能急性损害的重要原因,直接影响患者的恢复和术后生存率。因而,肝I/R损伤保护研究是肝脏外科领域一项重要的课题。肝I//R病理生理过程机制复杂,涉及能量代谢障碍、钙离子超载、微循环障碍、细胞因子、中性粒细胞、氧自由基作用等相关因素。目前,对肝I/R损伤程度的评价多采用肝酶(AST、ALT)、炎性因子(TNF-a)等生化检查指标。虽然这些生化指标可作为一个非常敏感指标反映肝脏损伤程度,但是还不能反映肝I/R后肝组织的形态学特征、微循环障碍及其在空间分布等方面的信息。同时,肝酶以及炎性因子等指标还存在受肝脏术后应急性反应、创伤以及溶血等多方面因素影响,由此可能产生假象,造成不必要再手术风险。磁共振弥散/张量成像(diffusion weighted/ tensor imaging, DWI/DTI)作为研究功能及微观影像学的重要方法之一,目前已经成为临床评估和生命科学研究重要的工具,在中枢神经系统和相关病变的基础研究已日趋成熟,但应用于腹部脏器还处于探索阶段。肝I/R的病理生理过程包括肝脏微循环的障碍、肝细胞内外水肿以及不断加重的肝细胞坏死等,这些病理过程使细胞内外水分子的运动状态、肝脏微循环的灌注量以及肝组织微观空间结构发生改变,这就使DWI/DTI监测和评估肝I/R的病理机制及发生、发展具有可行性。目前,DWI/DTI对肝I/R的研究尚处于探索阶段,各家结论尚未达成一致。CT灌注成像(computer tomography perfusion imaging., CTP)具有很高的时间和空间分辨率,作为一种有效、非创性的检查方法,能够同时在微血管的水平上直接评估组织的灌注情况和间接反应微血管形态特征。,而肝I/R是多机制、多种因素参与复杂的一个病理过程,其中肝I/R后肝脏微循环状态的差异性分布,即血液动力学的改变及伴随的肝脏灌注失败一直被认为是其病理过程中重要的因素之一,这正是如何准确评估肝I/R后肝组织微循环障碍所面临的瓶颈所在,是对以往采用肝酶等生化方法来评估肝脏损伤程度的一个很好补充。本实验拟采用新西兰大白兔制作部分肝I/R模型,探讨肝I/R后组织病理学、肝功能及TNF-a变化特点,探讨3.0 T DWI/DTI及CTP对兔肝I/R诊断价值,以期为肝I/R的诊断和治疗提供一种新的评价方法。第一部分兔部分肝缺血再灌注损伤模型的建立研究目的采用新西兰大白兔做部分肝I/R模型,拟探讨肝I/R后大体形态、组织病理、肝酶(ALT、AST、ALP)及肿瘤坏死因子a (TNF-a)变化特点,以期为肝I/R后功能影像学研究提供病理学基础。材料与方法1.实验动物健康成年、雄性新西兰大白兔,3~4月,体重2.5~3kg。所用实验兔术前均经腹部CTA检查了解肝动脉和门静脉解剖变异情况。2.肝I/R及sham模型的制作采用部分肝I/R模型,用无损伤性动脉夹夹闭入肝左叶管道结构(肝左动脉、门静脉左支及左肝管),肝右叶血供未阻断。阻断血供60min后,打开动脉夹恢复血流,肝左叶由暗红色变为鲜红,表示再灌注成功,关闭腹腔。I/R组按照再灌注时间,分为0.5h、2h、6h、12h、24h和48h组。sham组仅解剖肝十二指肠韧带,不阻断血供。3.生化及病理学检查3.1肝酶及TNF-a测定实验兔分别于MRI、CT检查结束后立即经上腔静脉抽取静脉血4ml(肝素管),离心后,分离血清,测定ALT、AST、ALP (U/L)及TNF-a (pg/ml)含量。3.2病理学检查取血样后,立即处死实验动物,整体摘取肝脏,肉眼观察大体标本表面和断面解剖特点。将解剖标本制成常规HE染色切片。显微镜下观察肝组织病理学改变,根据肝脏病变程度以半定量方法积分,按各种病变程度乘以不同加权数:肝细胞坏死×(0~3),肝细胞水肿×(0~3),炎细胞浸润×(0~3),淤血×(0~3),计算每只动物肝病变的总积分,然后进行统计学处理。4.统计学处理采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析:(1)I/R与sham组间肝酶、炎性因子及形态学积分均进行单因素方差分析(one-way ANOVA);(2)组织形态学积分与肝酶、TNF-a间关系采用Pearson相关;P<0.05作为差异有显著意义的检验标准。结果1.兔肝I/R模型构建成功造模并纳入实验78只,其中sham、0.5-24 h组,每组各12只;48h组6只。2.病理表现及生化检查2.1大体解剖在复血、氧后早期(0.5h、2h组),肝左叶表现为显著的充血肿胀、体积略增大,在其解剖断面上显示明显充血肿胀、肝窦内充满淤积红细胞;随着I/R后时间的延长,肝脏表面颜色逐渐变淡,变成苍白色,在I/R后48 h肝表面出现不规则墨绿色样变,肝段性坏死显著。而未阻断血供的肝右叶表现为显著充血肿胀。2.2镜下表现在I/R早期弥漫性肝细胞肿胀,肝细胞内明显水肿,肝窦间隙变窄,中央静脉、小动脉内红细胞大量淤积、微血栓形成(0.5h),随后汇管区出现成簇中性粒细胞,肝窦稍有萎缩,肝细胞水肿略有减轻,肝窦间及汇管区红细胞淤积,并出现少量炎性细胞,部分肝细胞核肿胀、细胞形态改变(2h);在I/R后6~12h,肝窦及肝实质聚集大量中性粒细胞,出现肝窦阻塞的现象,部分肝组织出现核固缩红染的凋亡细胞;在后期阶段(24~48h),未发生梗死的肝组织显示肝窦萎缩塌陷、解离,梗死区域细胞结构消失,出现溶解坏死的特征。2.3组织评分结果各I/R组镜下形态学评分值除0.5h组一过性性的升高外,总体趋势呈逐渐上升,在48h达到最峰值。各I/R组与sham组间存在显著性差异(F=172.702;P<0.001)。2.4 AST、ALT、ALP及TNF-a各I/R组血清ALT(F=325.531,P<0.001)、AST(F=1009.602, P<0.001)、ALP(F=1430.899,P<0.001)与sham (?)司均存在显著性差异。ALT峰值在再灌注后6h组,I/R后12~48h逐渐下降。AST在2h显著升高后,缓慢上升,在48h达到最高值;ALP在6h迅速升高,在I/R后24~48h维持峰值。I/R组血清TNF-a在再灌注后2h迅速升高,并在I/R后12~24h维持峰值,在48h组开始回落。而sham组,TNF- a保持在一个稳定的低水平。经统计学分析,各I/R组与sham间均存在显著性差异(F=172.702,P<0.001)。3.相关性分析组织形态学积分与TNF-a(r=0.788, P<0.001)、ALP(r=0.841)、AST (r=0.848, P<0.001)之间存在显著相关性。结论1.兔肝I/R模型制作简单、成功率高,并在复血、氧后48h多个时间点观察了其病理发生、发展过程,适合功能影像评价肝I/R实验研究的需求。2.肝I/R早期以肝细胞水肿、肝窦淤血等病理过程为主(0~2h);晚期阶段是以肝细胞凋亡、坏死为主(6~48h)。对损伤反应的差异性是其病理病理特点这一。3.肝细胞水肿、淤血、中性粒细胞浸润、TNF-a等因素是诱导肝I/R发生、发展的重要因素;组织形态学积分与肝酶、TNF-a具有显著相关性。4.肝I/R后中性粒细胞聚集、内皮细胞损伤、微循环障碍、肝窦萎缩、塌陷以及局灶性坏死等的病理变化特点为其功能成像学研究提供了病理学基础。第二部分兔部分肝缺血再灌注损伤3.0T弥散加权/张量成像研究目的旨在结合肝酶、肿瘤坏死因子(TNF-a)和病理学检查,探讨3.0 T DWI/DTI对兔肝I/R可行性及诊断价值。材料与方法1.动物模型的制作及分组实验兔分为sham与I/R组。肝I/R模型及sham组制作同第一部分。I/R组按照再灌注时间,分为0.5h、2h、6h、12h、24h与48h组。I/R与sham,每组各6只。2.检查方法及参数采用GE 3.0T Signa Excite扫描仪,8通道头正交线圈,轴位扫描。扫描参数:T2WI TR/TE 3200/85ms,矩阵288×224,层厚4 mm, NEX3,FOV 20cm×15 cm;T1WI TR/TE 8.5/4 ms,矩阵288×192,层厚4 mm, NEX,3,FOV 22cm×22 cm:EPI-DWI, TR/TE 2000/49.3 ms,矩阵128×128,层厚4 mm, NEX,4,FOV20cm×10cm;弥散方向:ALL模式(X、Y、Z三个方向)。弥散梯度因子b=50、100、200、300、500、600s/mm2;EPI-DTI序列,TR/TE 2000/49.3 ms, NEX,4,FOV20cm×10 cm,层厚4mm,矩阵128×128。b=100、300、600s/mm2。弥散方向:取6个方向同时进行;增强扫描采用T1WI增强,0.2 mmol/kg顺磁性对比剂Gd-DTPA及8ml生理盐水快速手动注入。3.MR图像分析采用GE AW4.3 FuncTool Performance工作站进行后处理,先对原始图像采用Correction程序对图像进行校正,以减少伪影和图像变形。重建出表观扩散系数(ADC)、平均扩散系数(DCavg)及各项异性系数(FA)图。感兴趣区(ROI):15~8mm2,分别测量ADC、DCavg及FA值,连续测量三个层面,取其平均值。4.组织学和生化检查同第一部分。5.统计学分析使用SPSS13.0软件进行统计学分析,P<0.05为差异有统计意义。多组均数差异的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以不同b值时MR-DWI/DTI参数作为因变量,肝酶、TNF-a及组织形态学积分作为自变量行多元线性回归分析,用复相关系数R来说明MR-DWI/DTI参数与肝酶、TNF-a及组织形态学积分的相关关系。结果1.影像学表现在0.5h组肝左叶T2WI信号弥漫性轻度增高,T1WI强化减低。而在2h组肝组织信号出现暂时性回复正常。再灌注后6~12h,肝脏的边缘出现T2WI上不均匀性点片状稍高信号以及相对应的强化减低区域。24h及48h组,出现明显的片状、楔形或整个肝段高信号(T2WI、DWI)及无强化的梗死区域,与未发生坏死的区域分界较为明显。随着损伤加重,梗死范围(强化减低区域)逐渐扩大。2.ADC值变化规律ADC的总体变化趋势是先显著下降(0.5h),再一过性升高(2h),经过6~12h缓慢上升后,24h再出现一个明显减低后,在48h明显升高。当b≤300s/mm2时,0.5h(均P<0.001)和24h组ADC显著低于sham组(b=50s/mm2,P=0.037;b=100s/mm2,P=0.020;b=200 s/mm2,P=0.016;b=300s/mm2,P=0.001)。值得注意是,ADC于2 h组明显升高(b≤300s/mm2较为显著),虽与sham组之间无明显差异。在6h组ADC显著升高,但仍低于sham组(b=50s/mm2,P=0.029;b=200s/mm2,P=0.013;b=300s/mm2,P=0.021)。12h组与sham间均无统计学差异。与sham对比,48h组ADC显著升高(b≥300s/mm2,均P<0.001)。3. DCavg值变化规律各I/R组DCavg与ADC变化特点基本类似:在0.5h组显著下降,且在b=100(P<0.001)、300s/mm2(P=0.008),与sham组间差异存在统计学意义;在I/R后2h显著升高,并在b=100s/mm2时,与sham组间存在统计学意义(P=0.021);b=100s/mm2(P=0.021)、300s/mm2(P=0.002)时,6h组较sham组显著升高;DCavg值于24 h组也出现一过性下降现象,并在b=100s/mm2(P=0.008)、300s/mm2(P=0.042)时,低于sham组;在I/R后48h显著升高,且随着b值增大,其与sham组间差异性越显著(b=300s/mm2,P=0.012;b=600s/mm2,P=0.002)。4.FA值变化特点在I/R早期(0.5h)FA显著升高(b=100s/mm2,P=0.032;b=300s/mm2,P<0.001)、2h显著减低(b=100 s/mm2,P<0.001;b=300s/mm2,P=0.004),并与sham组间差异均存在统计学意义。FA在6~2h组缓慢下降,与sham间无统计学差异。随着肝I/R损伤加重,FA在I/R后24~48h呈下降趋势,并在24 h(b=300s/mm2,P=0.018;b=600s/mm2,P=0.006)、48h(b=100s/mm2,P=0.044;b=300s/mm2,P<0.001;b=600s/mm2,P<0.001)与sham组间存在显著性差异。5.I/R与sham组血清肝酶及TNF-aI/R组血清ALT (F=121.404, P<0.001)、AST (F=489.615, P<0.001)、ALP(F=835.325,P<0.001)与sham对比显著升高,组间存在显著性差异。I/R组血清TNF-a水平明显升高,与sham组间存在显著性差异(F=171.803,P<0.001)。6.I/R及sham组组织形态学积分各I/R组镜下形态学积分总体趋势呈逐渐上升,与sham组间存在显著性差异(F=119.350,P<0.001)。7.多元线性回归分析ADC (b=100 s/mm2, R=0.756; b=500/mm2, R=0.782), FA (b=300 s/mm2,R=0.781)与肝酶等生化、病理指标间存在较好的相关性。结论1.肝I/R功能成像参数ADC. DCavg/FA具有复杂性和多变性特点,其成像参数在I/R后2h出现一过性回复的现象,与组织形态学积分等病理指标具有类似变化特点,是其病理机制的体现。2.在肝I/R组早期功能成像参数变化较为剧烈(b<300s/mm2),这可间接反映肝微循环障碍等病理信息;采用较大b值(b=500、600s/mm2),在I/R后期阶段功能成像参数与sham间具有较大差异,这对于准确反映I/R后肝组织损伤、坏死等病理过程具有重要意义。3.在肝I/R早期阶段,FA与DCavg变化呈相反的趋势(0.5~12 h);而在晚期阶段呈现逐渐下降特点(24~48h),这与肝I/R后肝组织不断溶解坏死,维持其正常微观空间结构消失相一致。4.肝酶等生化指标与ADC. DCavg/FA参数间存在较好的相关性,证实了DTI/DWI对肝I/R诊断可行性和临床应用价值。5. DTI/DWI可以作为一种非创性的功能成像反映肝I/R肝细胞的生理状态、微观形态学等方面信息,若结合其他功能成像方法,例如,灌注成像可促进对I/R模型探索研究,为临床的断和治疗提供了一种可行性评价方法。第三部分兔部分肝缺血/再灌注损伤CT灌注成像研究目的观察兔部分肝I/R后CT灌注(CTP)参数演变规律,分析CTP评估肝I/R血流动力学病理基础,并探讨对其最敏感、有效的灌注参数。材料与方法1.动物模型的制作及分组实验兔分为sham与I/R组。肝I/R模型及sham制作同第一部分。I/R组按照再灌注时间,分为0.5h、2h、6h、12h与24h组。I/R与sham,每组各6只。2.CT灌注检查方法采用Philips Brilliance iCT(探测器组合0.625mm×256)扫描仪,定位扫描后,确定灌注扫描范围,然后采用全肝灌注模式(JOG)对全肝及脾动态扫描。非离子型对比剂(5ml优维显,370mgI/ml)和生理盐水10ml。注射速率均为1.5ml/s,对比剂注入后延迟2s开始扫描,扫描时间1.5s,共扫描11次,扫描间隔3s。扫描参数:探测器128×0.625mm,层厚1mm,间距-0.5 mm, Pitch0.915,80Kv,100mAs,360°/0.4 s。3.图像后处理采用EBW4.0I Philips工作站,自动生成肝动脉灌注量(HAP)、门静脉灌注量(HPP)、总灌注量(TLP)、灌注指数(HPI)等灌注图。肝组织ROI的选取:0.5~3cm2。在I/R后2h内,ROI随机分布的肝左叶,每个层面测量3个ROI,连续测量三个层面;I/R后6-24 h在梗死区域(低灌注区,即强化减低肝组织)与未梗死区(相对正常的强化未减低肝组织)分别测量3个ROI,连续测量三个层面,计算出梗死与未梗死肝组织的平均值以及相应平均值。4.组织学和生化检查同第一部分。5.统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计分析。多组均数差异的比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA)。采用配对t检验比较以下CT灌注参数间有无统计学意义:(1)在6h、12h、24h组梗死与未梗死肝组织灌注参数比较;(2) sham与6h、12h、24h组肝左叶梗死肝组织灌注参数比较;(3)sham与6h、12h、24h组未梗死肝组织灌注参数比较。以梗死与未梗死肝组织中CT灌注参数为因变量,肝酶、TNF-α及组织形态学积分为自变量进行多元线性回归分析。用复相关系数(R)来说明CT灌注参数与肝酶、TNF-α及组织形态学积分的相关关系。P<0.05为差异有统计意义。结果1.各I/R与sham组间CT灌注变化特点与sham组相比,0.5h组表现为整个肝左叶的显著强化减低,2h组表现为明显均匀强化,在I/R后6h兔肝左叶呈现差异性灌注(低灌注区出现,即强化减低区),且随着再灌注时间的延长(12~24h),梗死的范围逐渐扩大,强化程度也呈减低趋势。2.CT灌注参数变化特点2.1总的变化趋势CT灌注参数在I/R早期(0.5h组)除HPI外,均表现为显著减低;HAP于2h显著升高后,在I/R后6~24 h均表现为逐渐下降;HPP一直低于sham,尤其是在I/R后0.5-2 h;TLP变化特点与HAP基本类似。HPI作为相对性指数,各I/R组均高于sham组。2.2梗死及未梗死肝组织CT灌注参数的变化特点HAP于6h组梗死肝组织显著上升后,在12h、24h组呈现逐渐下降的趋势,而在未梗死的肝组织中HAP是呈现逐渐下降的趋势(6~24h);HPP不论在梗死或未梗死的肝组织均呈现显著下降的趋势,但在梗死的肝组织内下降的幅度更大;TLP在梗死以及未梗死肝组织中变化特点与HPP基本类似;在梗死的肝组织内HPI显著升高,这也说明了肝动脉缓冲效应机制作用。3.相关性分析在肝I/R后梗死组织CT灌注参数与肝生化指标及组织形态学等多个自变量间的具有较好的线性相关,以梗死组织中HPP相关性最好(R=0.855)。结论1.在肝I/R后2h,CT强化模式以及CT灌注参数出现暂时性回复,是其“假正常化”病理机制的体现。2.在肝I/R后6h出现了灌注性差异,且随着时间的延长,其强化程度逐渐减低,梗死的范围逐渐扩大(12~24h),在I/R后24h出现局灶性坏死。3.肝I/R后,CT灌注参数出现了显著的差异性,在强化减低肝组织中I/R早期(2 h) HAP显著升高,而HPP明显降低,TLP保持相对稳定;HAP在梗死的肝组织(12~24h)明显高于未梗死的肝组织—肝脏动脉缓冲效应基础机制的存在。4.HAP在梗死的肝组织中虽明显升高(12~24h),但HPP与TLP显著降低,其根本原因是肝内门体分流(末端小动静脉开放),致使肝动脉缓冲效应作用降低,最终导致门静脉的灌注量减低(24 h)。肝血流量实际上减低,进一步加剧肝实质的损害。5.肝酶、TNF-α、形态学积分与梗死肝组织CT灌注参数间具有相关性。因此,CT灌注参数可以作为敏感、有效的指标监测肝I/R后血流动力学、肝组织的损伤及坏死程度敏感指标。