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缓慢激活延迟整流性钾离子通道(IKs)是由KCNQ1编码的α亚基和KCNE1编码的β亚基组成的异源多聚体，在心肌动作电位的复极化过程中发挥重要的作用。心肌IKS需要KCNQ1和KCNE1共同表达，KCNQ1异源表达能产生快激活、慢失活的外向电流，KCNE1单独表达并不能形成具有功能的通道，但是当KCNE1与KCNQ1共同表达时，可明显改变KCNQ1通道的电流特征，减慢通道激活速度，抑制失活过程，使得电压依赖性激活曲线明显右移，并且使通道电流幅度增加。关于KCNE1怎样与KCNQ1相互作用来调节KCNQ1通道功能目前还不是很清楚。在KCNQ1跨膜区S1和S2之间有一小段的氨基酸序列140～147，包含有六个与心律失常相关的突变位点，其中，S140G、V141M和Q147R这三个位点的突变导致心律失常发生需要同时表达KCNE1，并且发生在KCNE1胞外区域的突变也会使一些IKs激活剂的作用丧失。表明KCNQ1的跨膜区S1的胞外端参与了KCNQ1和KCNE1的相互作用。我们采用“二硫化物诱捕”的实验方法来观察KCNQ1 S1跨膜区与KCNE1在胞外区域的相互作用，首先采用定点突变的方法在KCNQ1和KCNE1特定的位置引入Cys，然后将突变型的KCNQ1与KCNE1表达在COS-7细胞，使用免疫印迹的实验方法来观察Q1、E1之间二硫键的形成，并使用双电极电压钳技术来观察离子通道功能。第一部分突变型KCNQ1和KCNE1保留了Q1通道功能和E1的调节作用采用定点突变的方法在Q1 145和E1 40～43位点引入Cys，先将Q1和E1中所有的内源性Cys用A1a代替，得到没有内源性Cys的Q1（Q1-（-Cys-）WT），然后将Q1跨膜片段S1的胞外端的145和E1胞外端40～43位点引入Cys，得到突变型Q1和E1。我们将三种KCNQ1，Q1-wT、Q1-（-cys-）-WT、Q1145C单独或者与E1 wT、E140C、E1 41C、E1 42C、E1 43C共同表达在爪蟾卵母细胞，然后用双电极电压钳技术来记录电流，观察通道功能的变化。实验结果显示当三种Q1单独表达的时候，其功能是相似的，表现出来的都是电压依赖性的快激活慢失活电流，用Ala代替了所有内源性的Cys后，通道动力学特性略有变化，其去激活的速度变慢，同时其电压依赖性的激活曲线左移，但是在145位点引入Cys，其功能没有出现进一步的改变，即突变型的Q1145C与Q1wT，Q1-（-cys-）-WT通道功能相似。当Q1与E1共同表达时，实验结果显示：无论是野生型（E1 wT）还是突变型E1（E1 40C～43C）均能导致Q1通道发生以下变化：去激活过程减慢，电压依赖性的激活曲线右移，同时电流幅度增加。因此我们所研究的突变型的KCNQ1均保留离子通道的功能，突变型KCNE1保留了与KCNQ1相互作用的能力，我们可以通过突变这些位点来研究KCNQ1与KCNE1的相互作用。第二部分KCNQ1 145与KCNE1 40和41的状态依赖性相互作用我们将Q1 145C单独或者与E1 40C～43C共同表达在COS-7细胞，用免疫印迹的方法观察Q1 145C与E1 40C～43C之间是否能形成二硫键来明确Q1 145与E1的作用位点；并且将能以二硫键交联的Q1／E1对共同表达在爪蟾卵母细胞，使用双电极电压钳的实验方法观察Q1／E1的相互作用对通道功能的影响。1．KCNQ1 145C与KCNE1 40C或41C的相互作用1．1 Q1 145C和E1 40C或41C可以形成二硫键免疫印迹的实验结果显示，当Q1 145单独表达的时候或与E1共同表达的时候，可以看到60-kD的Q1条带，当Q1145与E1 40C或E1 41C共同表达时，可以看到非常明显的80-kD条带，有时伴随有一个较弱的75-kD条带出现，80与60-kD的条带的灰度值的比值分别为0．30±0．03、0．12±0．05；当Q1145C与E1 WT共同表达的时候，80-kD位置没有任何条带出现；当Q1145C与E1 42C和E1 43C共同表达时，在80-kD位置仅见很微弱的条带，甚至没有条带出现，并且DTT可以使80或75-kD条带消失。分子量为80或75-kD的蛋白可能是以二硫键交联的Q1／E1复合物。结果表明Q1145C与E1 40C或E1 41C可以形成二硫键。1．2 E1 40C存在于双硫键交联的Q1 145C／E1 40C复合物中我们进一步证明，E1存在于二硫键交联的Q1 145C／E1 40C复合物中。当使用结合在E1羧基端的E1抗体来检测时，在80-kD的位置仅能看到非常微弱的条带，甚至没有条带显现。我们用免疫沉淀的方法选择性沉淀出与Q1以二硫键结合的E1，免疫沉淀实验结果显示，①E1 WT单独表达的时候，既没有显示60-kD的Q1条带，也没有显示E1条带，即E1 WT不能被Q1抗体免疫沉淀下来。表明了免疫沉淀反应的特异性。②Q1145C／E1 WT共同表达可以看到明显的60-kD的Q1条带，但是只能看到非常弱的E1条带，表明Q1 145C能够有效的被Q1抗体沉淀下来。③Q1 145C／E140C，不仅可以看到很强的60-kD的Q1条带，同时还可以看到非常明显的E1条带，这些E140C是从二硫键交联的Q1／E1复合物中游离出来的。因此，免疫沉淀的实验结果表明E1 40C存在于80或75-kD的二硫键交联的Q1／E1复合物中。1．3 Q1 145C／E1 40C复合物中含有糖基化和非糖基化的E1不同分子量的E1，除了15-kD的非糖基化的E1外，我们还可以看到16、20、23、28-kD的多个E1条带，当Q1 145与E1 40C或E1 41C共同表达，主要显示大小为80-kD，有时伴有一个较弱的75-kD的Q1／E1复合物条带。那么这些高分子量的E1是不是由于E1不同程度糖基化的结果呢?Q1／E1复合物有80或75-kD不同大小是否由于非糖基化和部分糖基化的E1所造成的呢?为了证明这些，我们用肽N-糖苷酶F（PNGase）使E1蛋白完全脱糖基化，实验结果显示，经过PNG酶处理，Q1 145C／E140C显示的80-kD条带减弱，而75-kD的条带增强，并且E1主要显示的是15-kD的条带。结果表明Q1 145C／E1 40C复合物中含有糖基化和非糖基化的E1，75-kD大小的Q1 145C／E1 40C的复合物主要含有的是非糖基化的E1。2．KCNQ1 145与KCNE1 40相互作用对通道功能的影响2．1二硫键的形成使Q1 145C／E1 40C通道稳定在激活状态我们将E1 40C与Q1 145C共同表达在爪蟾卵母细胞，用双电极电压钳记录电流，记录前预先用DTT 10 mM或25mM孵育10或者5分钟。结果显示，经DTT处理后，Q1145C／E1 40C通道显示非常明显的瞬间电流，激活电流曲线有两部分组成：瞬间电流和时间依赖性电流，瞬间电流的比例为42．3±7．3％；并且电压依赖性的激活曲线明显左移，其半数激活电压在DTT处理前后分别为32．3±4．0 mV和2．1±6．3mV。结果表明二硫键的形成使得Q1145C／E1 40C通道稳定在激活状态。2．2二硫键的形成使Q1 145C／E1 41通道稳定在静息状态将KCNE1 41C与Q1 145C共同表达在爪蟾卵母细胞中，用双电极电压钳记录电流，记录前预先用DTT 10 mM或25mM孵育10或者5分钟。结果显示，DTT处理前后Q1 145C／E1 41C通道均没有瞬间电流出现；DTT处理前，其半数激活电压为80．2±5．7mV，通道需要很正的电压才能激活，DTT处理后，电压依赖性的激活曲线左移，其半数激活电压为55．0±5．7 mV。结果表明二硫键的形成使Q1 145C／E1 41C使得通道稳定在静息状态。3．KCNQ1／KCNE1的相互作用具有状态依赖性3．1 Q1 145C与E1 40C在通道激活后才形成二硫键用瞬间电流的形成来观察Q1 145C／E1 40C二硫键的形成。在实验记录过程中，给予细胞一个从钳制电压-100mv去极化到+60mv的持续时间为2s，然后复极化到-60mv持续时间为2s的去极化刺激每个去极化刺激的间隔时间为1分钟。在DTT洗入前，Q1145C／E1 40C是慢激活的电流，DTT 10mM增加电流的幅度，十五分钟后，将浴槽中的DTT冲洗掉，在冲洗的过程中发现电流的总幅值逐步增加，而且瞬间电流的幅值也逐步增加。表明冲洗DTT的过程中，Q1 145C与E1 40C重新形成双硫键。如果在冲洗DTT的过程中，不给予细胞电压刺激，而使得细胞一直处于静息状态，待DTT完全冲洗干净后，继续给予细胞去极化刺激，结果显示，第一个刺激使得电流的幅度增加，电流仍然是慢激活电流，并且有很小的瞬间电流，一分钟后给予的第二个去极化刺激导致出现非常明显的瞬间电流，并且在随后的去极化刺激中，瞬间电流和总电流的幅值保持平稳。这两个实验结果都表明：当通道激活后，Q1 145C与E140C之间才形成二硫键。我们用另一个实验在进一步证实通道激活促进Q1 145C／E1 40C之间二硫键的形成。在COS-7细胞表达Q1 145C／E1 40C，用100mM K+溶液使细胞膜去极化，用westemblot观察Q1／E1复合物的存在。结果显示，高K+溶液使细胞膜去极化后，经DTT处理后消失的80-kD的条带重新出现。结果表明激活通道促进Q1 145C与E1 40C之间二硫键的形成。因此，当通道处于激活状态时，E1 40可以靠近Q1145，Q1145C与E1 40C能形成双硫键。3．2 Q1 145C／E1 40C形成双硫键的速率是1200 ms-1我们用一串短脉冲刺激来检测Q1 145C与E1 40C形成双硫键的速率。给予从钳制电压-100mv到+600mv的去极化的串刺激，持续时间是0．2秒，刺激的时间间隔是15秒。结果显示，瞬间电流逐步增加，瞬间电流形成的时间常数用单指数方程拟合，为0．85±0．14秒，二硫键形成的速率是该时间常数的倒数，为1200 ms-1。3．3 Q1 145C与E1 41C在静息状态下形成双硫键，其形成速率为2．4ms-1我们将E1 41C与Q1145C共同表达在爪蟾卵母细胞中，给予从钳制电位-100nmv到+60mv，持续时间为2秒、刺激时间间隔为为60s的去极化刺激，记录电流DTT对电流幅度的影响。实验结果显示，DTT 10mM使电流幅度逐渐增加，可能是由于DTT打断了Q1 145C与E1 41C之间的二硫键，通道容易开放，电流幅度增加。结果表明当通道处于静息状态时，E1 41可以靠近Q1145，Q1145C和E1 40C能形成二硫键。在DTT冲洗过程中，我们可以看到电流幅度逐渐下降，可能是由于Q1 145C与E1 41C又重新形成二硫键所致。电流幅度降低的时间常数用单指数方程拟合，其值为425±86s，因此Q1145C与E1 41C之间的二硫键形成的速率为2．4ms-1。结论：研究结果表明KCNQ1与KCNE1在胞外区可呈状态依赖性相互作用：①在Q1 145和E1 40或41的位点引入Cys，这两个Cys之间可形成二硫键。②Q1145C／E140C通道经DTT处理后显示明显的瞬间电流，这个瞬间电流是由于通道被激活后，Q1 145C与E1 40C形成二硫键所致，并且形成的二硫键使通道稳定在激活状态。③Q1145／E1 41C需要非常正的电压才能够被激活，DTT使电压依赖性激活曲线明显左移，表明Q1 145C与E1 41C在静息状态下形成二硫键，并且使离子通道稳定在静息状态。以往研究表明KCNE1的跨膜区可KCNQ1的跨膜区S6和S4相互作用。因此，可以推断KCNE1位于KCNQ1两个毗邻亚基的电压依赖性区跨膜区之间，紧靠第三个亚基的孔区，可以同时和三个独立亚基的S1、S4、S6跨膜区发生作用。KCNE1的不同位点40和41在通道处于不同状态的时候可以很靠近KCNQ1的相同位点145，表明KCNE1不是静止不动的，它是以动态的方式，状态依赖性调控KCNQ1通道。