胰高血糖素样肽-1受体(glucagon like-peptide-1 receptor, GLP-1R)属于B-簇G-蛋白偶联受体，是设计2-型糖尿病药物的重要靶点之一。GLP-1R由一个相对较大的N-端胞外域﹑七段α-螺旋跨膜结构域及较小的胞内C-端域构成。尽管通过结构生物学，蛋白质工程等方法和手段对于GLP-1R结构的研究取得了较大突破。但是关于其全长结构解析，配体-受体结合的分子机理和受体激活的内在机制尚不清楚。因此，相关研究需要制备高质量GLP-1R蛋白样品以供蛋白结构生物学研究。
　　目前，常用的制备膜蛋白方法主要包括大肠表达系统﹑酵母表达系统﹑细胞表达系统，杆状病毒表达系统及无细胞表达系统。其中，后三种方法在制备膜蛋白方面成本高，表达量低等。因此，我们综合了原核表达系统和真核表达系统的优势(周期短，产量高等)，建立一种利用微生物蛋白表达系统制备全长膜蛋白GLP-1R的方法。首先，运用毕赤酵母表达系统制备GLP-1R胞外域(ECD)，其优势在于所表达的ECD能够在真核系统氧化还原条件下形成正确的蛋白构象折叠。利用pPICZaA作为出发载体，引入多个标签基因(GST,intein)构建重组载体pPICZaA-S。通过甲醇诱导ECD融合蛋白分泌表达。其次，通过构建pMFH-TMD重组质粒，利用IPTG诱导大肠杆菌制备GLP-1R跨膜域(TMD)。其优势在于选用的MFH作为融合蛋白表达TMD主要是以包涵体形式存在，避免胞内蛋白酶的降解。所表达的融合蛋白含有MFH标签，TEV酶切位点以及半胱氨酸并利用表面活性剂来溶解和纯化融合蛋白。在一定表面活性剂条件下，可通过TEV酶切割并释放出含有游离半胱氨酸(Cys)的目标蛋白TMD。最后，胞外域ECD和跨膜域TMD在intein介导下自发形成新的硫脂键实现两部分蛋白的体外连接。
　　本实验研究中，一方面，构建了重组载体pMFH-TMD在大肠杆菌BL21pLysS中高效表达。通过优化表达条件表明18℃，0.5mMIPTG诱导20h效果较佳；而且进一步探索表明SDS能够较好的溶解和纯化融合蛋白MFH-TMD。在低含量SDS情况下，TEV酶仍然具有一定的切割活性。另一方面，构建了重组载体pPICZaA-S并将该重组基因整合到毕赤酵母X33中。在0.5%甲醇诱导下，该融合蛋白能够较好的分泌于发酵液中。最后，利用透析除盐和镍柱纯化实现目的蛋白的富集。
　　本研究提供了一种高效制备膜蛋白GLP-1R的方法。该方法不仅可以为其他膜蛋白制备提供了新型策略。而且能够为小分子药物的筛选提供理论依据。