论文部分内容阅读
草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)感染引起的传染性草鱼出血病,严重制约了草鱼养殖产业的健康有序发展。赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)和草鱼(Ctenopharymgodon idellus)同属于鲤科,雅罗鱼亚科。基于课题组团队的前期研究结果赤眼鳟和草鱼对GCRV的不同表型性状,为探讨TLRs(Toll like receptors)通路中相关基因的表达特性,本研究克隆赤眼鳟TLRs通路中相关基因,分析其应对GCRV的表达特性;并结合分子生物学、细胞生物学和生物信息学方法对比分析赤眼鳟TLR22(ScTLR22)和草鱼TLR22(CiTLR22)在识别和应对GCRV感染的功能差异,以期从TLRs受体层面对赤眼鳟和草鱼表现出不同的GCRV抗性表型提供一定的理论依据。主要研究结果如下:1赤眼鳟TLRs通路抗病毒相关基因克隆与表达特性分析对赤眼鳟TLRs通路中抗病毒相关基因TLR22,MyD88(Myeloid differentiation primary response protein 88)和IRF3(IFN regulatory factor 3)基因进行了cDNA克隆和应对GCRV的表达特性分析。结果显示:赤眼鳟TLR22,MyD88和IRF3均参与了机体的抗GCRV病毒免疫反应,且体外过表达赤眼鳟TLR22和IRF3能抑制GCRV在CIK细胞中的复制。2赤眼鳟和草鱼TLR22基因的结构特征分析对赤眼鳟和草鱼TLR22结构特性比较分析结果显示,ScTLR22最后一个LRR(LRR18)在LRR-CT(C-terminal LRR domain)上游12个氨基酸处,和斑马鱼、鲤鱼相似,而CiTLR22的最后一个LRR(LRR17)在LRR-CT上游60个氨基酸处;ScTLR22的TIR结构域中3个保守区域氨基酸序列和斑马鱼、鲤鱼等完全一致,而和草鱼相比,Box1和Box2中均有一个氨基酸突变。为探讨赤眼鳟和草鱼TLR22识别区域的结构差异是否导致不同的识别能力,对赤眼鳟和草鱼TLR22的识别区域和dsRNA类似物poly(I:C)的分子对接结果显示:ScTLR22和poly(I:C)形成的复合物在绑定能、分子间能量、氢键数量和键长等方面均优于CiTLR22。因此推断,ScTLR22胞外识别区域结合poly(I:C)的能力比CiTLR22强。3赤眼鳟和草鱼TLR22识别GCRV诱导抗病毒因子表达能力比较为验证赤眼鳟和草鱼TLR22识别区域结构差异和功能的关系,分别在CIK(Ctenopharyngodon idella kidney)细胞中过表达ScTLR22、CiTLR22和融合表达ScTLR22的识别区域和CiTLR22跨膜结构域和TIR信号传导结构域(ScE/CiC),并检测GCRV感染相关抗病毒因子的表达水平变化。结果显示,GCRV感染后,IRF3、IFN-β和IL-1β的表达水平在过表达ScTLR22、CiTLR22和ScE/CiC的CIK细胞中显著上调表达;且过表达ScE/CiC的CIK细胞中IFN-β和IL-1β表达水平显著高于过表达ScTLR22和CiTLR22的CIK(P<0.05)。同时,过表达ScE/CiC的CIK细胞对GCRV敏感性显著低于过表达CiTLR22的CIK(P<0.05)。因此,ScTLR22的胞外识别区域识别GCRV后诱导IFN-β和IL-1β表达,抵抗GCRV入侵的能力优于CiTLR22。综上所述,赤眼鳟TLR22、MyD88和IRF3均参与了机体的抗GCRV病毒免疫反应,同时赤眼鳟和草鱼TLR22胞外识别区域的结构差异,导致它们对GCRV的识别能力的不同,影响IFN-β和IL-1β等抗病毒因子的表达,导致不同的抗性表型。本研究结果有助于从TLRs受体层面解释草鱼和赤眼鳟对GCRV的不同表型性状。