论文部分内容阅读
目的:1.研究白藜芦醇对氧化应激诱导的心肌细胞凋亡的保护作用;2.初步探讨白藜芦醇对SIRTs （SIRT1-7）的表达影响。方法:大鼠心肌细胞株H9c2培养48 h后随机分为3组,①正常对照组:不行任何处理;②氧化应激组:弃去旧培养液,加入不含血清的DMEM,培养30 min后再加入终浓度为50μmol/L H2O2;③20μmol/L白藜芦醇（resveratrol, Res）干预组:在加入H2O2前30 min加入20μmol/L Res预处理。以上各实验组细胞在37℃条件下继续培养6 h后终止。试验各组细胞检测指标均相同。噻唑蓝（MTT）比色法测定细胞活力;末端脱氧核苷酰基转移酶介导的dUTP切口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP nick-end labeing, TUNEL）技术和流式细胞仪（flow cytometer, FCM） PI染色法分析细胞凋亡;RT-PCR法检测SIRT1-7 mRNA表达水平的变化;Western blot法检测SIRT1-7及Caspase-3蛋白表达的变化。结果:1.为分析不同浓度Res对H9c2细胞活力的影响,分别用0、10、20、50、100μM Res处理24 h进行MTT检测。结果表明:10μM和20μM处理组光密度值（OD值）均高于对照组,20μM Res组作用最显著（P<0.05）,50μM组开始下降,低于对照组（P>0.05）,100μM组降至最低（P<0.05）。2.H9c2细胞分别用10, 50和100μM H2O2处理6 h后,用MTT法检测细胞活力。结果表明:各处理组的光密度值均低于正常对照组,与正常对照组比较,50μM组（P<0.05）,而100μM组（P<0.01）;在加入H2O2前,用20μM Res预处理30 min发现心肌细胞活力明显升高,以50μM组最显著（P<0.05）。3.TUNEL法检测细胞凋亡率在正常对照组细胞为1.56%,氧化应激6 h后细胞的凋亡率（16.98%）明显增加（P<0.05）,Res干预组（8.65%）较氧化应激组明显降低（P<0.05）。FCM法分析Sub-G1百分率结果和TUNEL法结果一致。正常对照组的细胞未见亚二倍体凋亡峰（Sub-G1=1.04%）;50μM H2O2处理6 h后,在G0/G1期峰前出现亚二倍体凋亡峰（Sub-G1=8.56%）;而20μM Res预处理后亚二倍体凋亡峰减小（Sub-G1=1.98%）。但是,在Res预处理前加用sirtuin抑制剂尼克酰胺（nicotinamide, Nam）阻断SIRTs的表达后,Res的抗凋亡作用被逆转。与Res干预组比较,Nam干预组细胞凋亡率（18.23%）及Sub-G1百分率（9.01%）明显升高（P<0.05）。4.H9c2细胞用50μM H2O2处理6 h后,SIRT1,3,4,7 mRNA的表达与正常对照组比较明显降低（P<0.05）;而20μM Res预处理后,SIRT1,3,4,7 mRNA的表达与氧化应激组比较明显增加（P<0.05）。SIRT2, 5, 6 mRNA的表达在三组中没有差异。5.SIRT1-7蛋白表达水平的变化与SIRT 1-7 mRNA表达水平的变化一致。H9c2细胞用50μM H2O2处理6 h后,内源性SIRT1,3,4,7的表达与正常对照组比较明显降低（P<0.05）;而20μM Res预处理后,SIRT1,3,4,7的表达与氧化应激组比较明显增加（P<0.05）。SIRT2, 5, 6的表达在三组中没有差异。6.Caspase-3在正常对照组表达最低,H2O2处理后它的表达明显增加（P<0.05）,而Res干预组较氧化应激组明显降低（P<0.05）。结论:1.Res能抑制氧化应激诱导的心肌细胞凋亡;2.Res在氧化应激情况下能够同时激活SIRT1,3,4,7,而对SIRT2,5,6的表达没有影响;初步推测Res的保护作用可能与SIRT1,3,4,7的抗应激作用相关。