【摘 要】
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蛋白生物标志物的高灵敏检测对揭示疾病发展病理过程、辅助疾病早期诊断具有重要价值。本课题拟整合固相界面上的靶标特异性识别和均相溶液中的指数转录扩增,设计了一种新颖、通用的高灵敏蛋白质检测新策略。本文以血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)为模型靶标,首先将靶标VEGF捕获在预先包被了抗VEGF多克隆抗体的96孔板上,引入生物素标记的抗VEG
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蛋白生物标志物的高灵敏检测对揭示疾病发展病理过程、辅助疾病早期诊断具有重要价值。本课题拟整合固相界面上的靶标特异性识别和均相溶液中的指数转录扩增,设计了一种新颖、通用的高灵敏蛋白质检测新策略。本文以血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)为模型靶标,首先将靶标VEGF捕获在预先包被了抗VEGF多克隆抗体的96孔板上,引入生物素标记的抗VEGF单克隆抗体以形成“三明治”免疫复合物,从而实现在固相界面上对靶蛋白的特异性识别。随后,以链霉亲和素(SA)作为“桥梁”在免疫复合物上结合生物素标记的DNA(bio-DNA)探针。最后,被锚定的bio-DNA作为触发均相指数转录(HET)过程的启动链,在均相恒温条件下高效指数扩增产生大量单链RNA产物。通过上述反应过程可将固相界面上的靶蛋白识别信息有效转化为溶液中指数扩增的大量核酸信息用于荧光检测。经验证,该方法在0.01-1000 pg/mL VEGF浓度范围内呈现了良好的线性相关性,检测限可低至1 fg/mL,比传统的ELISA方法检测限低3个数量级。此外,该方法可直接检测肿瘤细胞培养上清液和不同类型临床病人体液样本中的VEGF含量,具有较高的灵敏度和选择性,且受干扰物质影响小。本文建立的基于界面识别诱导转录扩增的免疫传感策略有望用于低丰度蛋白生物标志物的超灵敏检测,有望为临床早期诊断、早期治疗和预后判断提供重要技术支持。
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