心脑血管疾病已然成为引起人类死亡的首要原因,深入了解心脑血管疾病的发病机制,开发有效的治疗药物已经迫不及待。离子通道在心脑血管疾病发生发展中发挥了重要的作用。最近,短暂性受体电位(TRP)离子通道在心脑血管系统生理病理中的作用引起了人们的广泛关注。至今发现的30多种TRP通道绝大多数表达在中枢神经系统,其中至少有19种也在内皮细胞中所有表达。TRPM7作为TRP通道melastatin家族的第7号成员,因为结构特殊、表达广泛、功能众多而受到关注。首先,TRPM7除了具有离子通道结构域,在其C末端含有一个激酶结构域,又被称为通道酶。TRPM7的活性受到多种因素的调节包括自身蛋白的磷酸化、胞内的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)、pH值、氧化应激、机械应力、血管活性物质等,暗示其生物功能的多样性。其次,TRPM7广泛分布于各种组织和器官,包括心脏、大脑、肺、肝脏、血管等等。再次,TRPM7调节各种各样的生理病理过程,例如调节细胞的增值、迁移、粘附、凋亡、炎症反应、离子平衡等。越来越多的证据显示TRPM7在脑组织和心血管系统的生理病理过程中发挥了非常重要的调节作用,参与调节脑卒中、高血压、心房颤动、心脏的早期发育、血管内皮细胞的增殖迁移、平滑肌细胞的增殖和镁离子稳态等。例如,脑缺血或氧糖剥夺(OGD)产生的超氧阴离子可以激活TRPM7,导致神经元细胞的钙离子内流增加,增加神经元细胞的损伤,而抑制TRPM7的活性或干扰其表达都能显著抑制神经元细胞的钙离子内流和损伤。血管内皮细胞和星形胶质细胞分别作为心血管系统和中枢神经系统中重要的组成部分,发挥了重要的生理和病理功能。血管内皮细胞是指血管内膜表面的一层细胞,主要参与血管的收缩和舒张、凝血、动脉硬化、血管生成以及炎症等生理病理过程。之前的研究发现,干扰TRPM7在人脐静脉内皮细胞中的表达增加了细胞的增殖和迁移,保护了高糖诱导的内皮损伤。暗示TRPM7在血管内皮中扮演重要角色。而星形胶质细胞是中枢神经系统中的数量最多的细胞,是神经元细胞的6-10倍。星形胶质细胞的伪足既可以延伸入到神经细胞周围,发挥其支持和滋养神经元、分泌和吸收神经递质、调节离子平衡以及参与免疫反应等作用,又可以附着在邻近的毛细血管壁上,调节血管张力和血脑屏障。TRPM7在大脑中的表达较高,又参与了脑缺血诱导的神经元损伤,但在星形胶质细胞中的作用还不是很清楚,所以本项目通过研究TRPM7调节细胞生理的分子机制来完成以下几个目的。1.以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为血管内皮模型,通过研究TRPM7对的血管内皮细胞的形态、粘附、迁移、体外血管新生等生理过程的影响及其分子机制来探讨TRPM7对血管内皮功能调节作用,为TRPM7作为治疗心脑血管疾病药物靶点的提供可靠的实验依据。2.通过研究功能性的离子通道TRPM7在星形胶质细胞中的表达、对细胞增殖和迁移的影响及其分子机制,探讨TRPM7对大脑胶质细胞功能的调节,为治疗中枢神经系统疾病的提供潜在的新药物靶点。1.利用小干扰RNA (siRN A)特异性地干扰HUVEC中TRPM7通道mRNA和蛋白的表达,通过实时定量聚合酶链式反应(quantitative real time-PCR, qPCR)和电生理的方法来验证siRNA的干扰效率。2.观察和定量分析干扰TRPM7表达后HUVEC的形态变化及其对细胞外基质(matrigel)的粘附能力的变化。3.利用迁移小室(transwell)和划痕实验研究干扰TRPM7表达后HUVEC与正常对照细胞间迁移能力变化。4.通过内皮细胞在matrigel上形成血管样结构来分析干扰TRPM7表达之后对HUVEC体外血管生成的影响。5.通过免疫蛋白印迹或者qPCR的方法研究干扰TRPM7表达后的HUVEC的MEK1/2和肌球蛋白轻链(MLC)分子的磷酸化水平,以及其他钙离子调节相关基因如Orai1、Stim1、TRPC3和TRPC1的表达。6.利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫蛋白印迹和电生理的方法检测功能性TRPM7通道在星形胶质细胞中的表达。7.利用特异性的siRNA降低TRPM7在星形胶质细胞中的表达,然后通过RT-PCR, qPCR、免疫蛋白印迹和电生理的方法来验证siRNA的干扰效率以及TRPM7通道功能的抑制。8.通过检测细胞内乳酸脱氢酶(LDH)含量和细胞划痕实验分别来研究TRPM7在星形胶质细胞增殖和迁移中的作用。9.利用免疫蛋白印迹方法,研究TRPM7调节星形胶质细胞增殖和迁移过程的分子机制。10.利用镁离子浓度试剂盒和流式细胞术研究TRPM7对星形胶质细胞内钙离子和镁离子浓度的影响。11.通过细胞增殖实验研究胞外的钙、镁离子对TRPM7调节的星形胶质细胞增殖的影响。1. qPCR的结果显示,转染TRPM7 siRNA-1和siRNA-272小时后HUVEC的TRPM7 mRNA的表达水平分别下降到了～39.67%和～29.49%。电生理实验全细胞膜片钳的结果也显示HUVEC细胞膜上的TRPM7样的电流密度也显著性地降低了,当细胞膜的电压钳制在-80 mv时TRPM7电流密度下降了-63.8%,当钳制在+80 mv时下降了～45.5%。同时,对HUVEC胞内镁离子检测发现,与对照组相比,干扰TRPM7后镁离子浓度显著下降～10%。提示siRNA有效的干扰了H UVEC中TRPM7的表达和功能。2.干扰TRPM7表达后HUVEC的形态发生明显变化(从扁平多角形状变成细长状)。对单细胞平均表面积进行统计分析,结果显示干扰TRPM7后单细胞的平均表面积降低了～50%。随后粘附实验结果显示,HUVEC对细胞外基质的粘附能力也显著下降了～45.67%。3. Tranwell实验和划痕实验的结果显示,干扰TRPM7表达后的HUVEC,与对照组相比,迁移能力和损伤修复能力分别增加了～300%和～56.64%,而且HUVEC早期(4小时)体外血管生成能力也增加了-39.5%。4.分子机制研究发现,干扰fRPM7表达后,HUVEC的MEK和MLC的磷酸化水平明显增加,而使用MEK的特异性抑制剂U0126后,干扰TRPM7诱导的MLC磷酸化水平与对照组没有差异。同时,U0126也能够显著性的抑制TRPM7调节的HUVEC的形态变化以及细胞迁移增加。提示TRPM7调节HUVEC的生理过程可能是通过MEK/ERK/MLC信号通路。5. qPCR和免疫蛋白印迹实验结果显示,转染TRPM7 siRNA后并不影响HUVEC的TRPC3、Orai1、Stim1基因的表达,但显著性地上调了TRPC1的mRNA和蛋白表达。6.体外成功分离和培养了小鼠大脑皮层原代星形胶质细胞,经细胞免疫荧光实验鉴定纯度高达95%以上。7. RT-PCR和细胞免疫荧光实验结果显示星形胶质细胞表达TRPM7的mRNA和蛋白。同时,利用全细胞膜片钳技术检测到星形胶质细胞膜表面表达TRPM7样的电流。8.转染TRPM7 siRNA-1和siRNA-2都能够显著性地降低星形胶质细胞中的TRPM7 mRNA和蛋白的表达,而不影响TRPM4和RPM6的nRNA表达。进一步实验显示TRPM7 siRNA-1能显著性地降低TRPM7的mRNA表达和电流密度。9.干扰TRPM7的表达或抑制TRPM7的活性导致星形胶质细胞的增殖和迁移能力显著下降。免疫蛋白印迹实验结果显示,干扰TRPM7的表达导致星形胶质细胞MAPK信号通路中的ERK1/2和JNK分子的磷酸化水平分别下降了～24.37%和～36.64%,而p38和Akt的磷酸化水平没有变化。同时,TRPM7的抑制剂2-APB也抑制了星形胶质细胞ERK和JNK的磷酸化水平。10.MEK和JNK信号通路的选择性抑制剂U0126和SP600125分别都显著性地抑制了星形胶质细胞增殖和迁移。暗示TRPM7调节星形胶质细胞的增殖和迁移是通过ERK和JNK信号通路。11.在四环素诱导的过表达TRPM7的HEK293细胞中胞内的镁离子浓度显著增加了～73.2%,而干扰TRPM7表达后星形胶质细胞内的镁离子浓度显著下降了-43.5%,但流式细胞术的实验结果显示钙离子水平并没有受到影响。但是细胞外添加镁离子并不能挽救干扰TRPM7表达导致的细胞增殖抑制。结论1.TRPM7在人脐静脉内皮细胞中总体上呈现出一种负调控作用,特异性的干扰TRPM7表达改变了细胞的形态,促进细胞的迁移和早期血管生成,上调TRPC1的表达,有利于保护内皮的部分功能,这一过程可能受到MEK/ERK/MLC信号通路的调节。TRPM7可能成为一个新的调节内皮细胞生理功能的药物靶点。2.星形胶质细胞表达功能性的TRPM7通道,干扰TRPM7表达或抑制其活性损伤ERK和JNK信号通路的活化,抑制星形胶质细胞的增殖和迁移。虽然TRPM7可以调节星形胶质细胞内的镁离子浓度,但细胞外添加镁离子并不影响星形胶质细胞的增殖,也无法挽救干扰TRPM7导致的细胞增殖抑制。TRPM7可能成为一个新的调节星形胶质细胞的生理功能的药物靶点。3.本文的研究阐述了TRPM7在心脑血管部分生理功能中的作用及分子机制,为心脑血管性疾病的诊断治疗提供实验依据,为TRPM7在血管和神经领域的交叉研究以及相关疾病的预防诊断治疗提供新的思路。