论文部分内容阅读
研究背景和目的:前列腺癌是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤,内分泌治疗是晚期前列腺癌患者的主要治疗措施之一,但大部分患者逐渐出现去势抵抗,现有的临床治疗措施效果尚不令人满意,因此有必要从中药中寻找抑制前列腺癌的药物。灯盏花素是从灯盏花中提取的黄酮类有效成分,其对脑卒中和心血管疾病有一定的治疗效果。近年的文献报道灯盏花素对某些恶性肿瘤亦有抑制作用,但灯盏花素对前列腺癌的抑制作用和分子机制尚不明确。本研究目的在于通过体内和体外实验探讨灯盏花素对前列腺癌的作用以及相关分子机制,为晚期前列腺癌的治疗提供新的思路和方法。研究方法:1、不同浓度灯盏花素处理前列腺癌LNCap和PC3细胞,镜下观察细胞形态变化,MTT比色法检测前列腺癌LNCap和PC3细胞细胞活力。不同浓度灯盏花素处理正常前列腺细胞RWPE-1和正常肝细胞L-02,MTT实验检测正常前列腺腺上皮细胞RWPE-1和正常肝细胞L-02的细胞活力。2、流式细胞术检测不同浓度灯盏花素处理后LNCap和PC3细胞细胞周期分布。Alexa Fluor 488 Annexin V/PI双染标记法对不同浓度灯盏花素处理后LNCap和PC3细胞细胞凋亡进行检测。3、Western blot法检测不同浓度灯盏花素处理后LNCap和PC3细胞的细胞周期检查点相关蛋白(p-ATM、p-ATR、p-CHK1、p-CHK2)和细胞周期相关蛋白(PCNA、Cyclin D1、p21、p27、Rb、p-Rb)的蛋白表达变化。4、Western blot法检测不同浓度灯盏花素处理后LNCap和PC3细胞凋亡相关因子(活化Caspase-3、活化PARP、Bax、Bcl-2)的蛋白表达变化。5、Western blot法检测不同浓度灯盏花素处理后LNCap和PC3细胞的MCM7和γH2AX蛋白表达。6、灯盏花素处理后,将MCM7过表达质粒转染LNCap细胞,Western blot法检测MCM7和γH2AX蛋白表达变化,MTT比色法检测细胞活力变化,流式细胞术检测细胞周期变化,双染标记法检测凋亡细胞比例变化。7、灯盏花素处理后,γH2AX siRNA转染LNCap细胞,MTT比色法检测细胞活力变化,流式细胞术检测细胞周期变化和凋亡细胞比例变化。正反验证灯盏花素是否确实通过MCM7/γH2AX抑制前列腺癌细胞增殖、诱导细胞停滞和细胞凋亡。8、收获对数生长期的LNCap和PC3前列腺癌细胞,分别接种于裸鼠皮下,建立皮下移植瘤,各组裸鼠腹腔内注射不同剂量的灯盏花素,观察裸鼠健康状况和移植瘤生长情况,21天处死裸鼠,切除移植瘤称重,免疫组织化学检测MCM7、Ki67、TUNEL表达,Western blot检测MCM7和γH2AX蛋白表达,Western blot亦检测细胞周期检查点相关蛋白(p-ATM、p-ATR、p-CHK1、p-CHK2)、细胞周期相关蛋白(PCNA、Cyclin D1、p21、p27、Rb、p-Rb)和凋亡相关因子(活化Caspase-3、活化PARP、Bax、Bcl-2)的表达情况、定量PCR检测PCNA、Cyclin D1、p21、p27基因mRNA表达水平,进一步体内验证灯盏花素对前列腺癌的抑制作用和分子机制。研究结果:1、MTT比色法实验结果显示灯盏花素对LNCap和PC3前列腺癌细胞生长有显著的抑制作用,并随浓度的增加而增强,呈剂量依赖性。而灯盏花素对正常前列腺腺上皮细胞和肝细胞毒性低。2、流式细胞术检测结果显示,随着灯盏花素浓度升高,LNCap和PC3细胞细胞周期G0/G1比例升高。Alexa Fluor 488 Annexin V/PI双染标记法实验显示,随着灯盏花素浓度升高,LNCap和PC3细胞细胞凋亡比例升高。3、Western blot检测结果显示,随着灯盏花素浓度升高,LNCap和PC3细胞的细胞周期检查点相关蛋白(p-ATM、p-ATR、p-CHK1、p-CHK2),细胞周期相关蛋白PCNA、Cyclin D1、p-Rb表达显著降低,p21和p27蛋白表达则显著上升,而Rb蛋白表达没有显著变化,凋亡相关因子Bax、活化Caspase-3、活化PARP表达显著升高,Bcl-2表达则显著降低。4、随着灯盏花素浓度升高,MCM7蛋白表达下降,而γH2AX蛋白表达上升,上调MCM7基因表达可部分逆转下游γH2AX蛋白的表达以及灯盏花素的抑制细胞生长、诱导细胞停滞和诱导凋亡的作用。而下调γH2AX表达可部分逆转灯盏花素对癌细胞的生长抑制、细胞停滞和诱导凋亡作用。5、灯盏花素对裸鼠移植瘤治疗实验结果显示,灯盏花素治疗组肿瘤生长明显减缓,并随药物剂量升高抑制肿瘤能力显著上升。免疫组化染色结果显示随着灯盏花素剂量升高,肿瘤组织中MCM7、Ki67表达显著下降,而TUNEL表达显著上升。Western blot法检测结果显示,随着灯盏花素浓度升高,MCM7表达显著下调,γH2AX表达上调,细胞周期检查点相关蛋白(p-ATM、p-ATR、p-CHK1、p-CHK2)上调,细胞周期相关蛋白(PCNA、Cyclin D1下调,p21、p27上调,p-Rb下调),凋亡相关因子(活化Caspase-3、活化PARP上调,Bax上调,Bcl-2下调)研究结论:1、灯盏花素对前列腺癌细胞有抑制作用,且呈剂量依赖性。2、灯盏花素诱导了前列腺癌细胞的G1期停滞和细胞凋亡。3、灯盏花素通过调控MCM7/γH2AX信号通路导致DNA损伤,进而激活DNA损伤修复通路和凋亡相关通路,诱导前列腺癌细胞周期停滞和凋亡发生进而抑制前列腺癌细胞生长。