研究背景乳腺癌位居女性恶性肿瘤发病之首,且致死率占第二位。2018年全球肿瘤发病与死亡报告中指出,每年乳腺癌新发病例约有209万例,其中约有63万例患者死于乳腺癌。但目前为止乳腺癌发生发展机制并不明确,加之缺乏早期诊断的特异性指标和较为有效的治疗方案,乳腺癌已然成为危害全球女性健康的重大问题。乳腺癌细胞增殖能力活跃且极易发生远处转移,这是病人预后差的关键原因。但乳腺癌发病因素复杂多样,疾病的一级预防尤为困难。因此探究乳腺癌的发生发展机制极为重要。任何肿瘤的发生发展过程都离不开肿瘤微环境。在微环境中,肿瘤生长经历两个时期:无血管期和血管期;在无血管期,肿瘤直径一般不会超过1-2mm,但是一旦进入血管期,肿瘤实体组织迅速生长且极易发生远处转移。由此可见,新生血管形成不管是在肿瘤的起源,还是远处转移都起着至关重要的作用。抗血管治疗作为临床治疗的主要手段,在切断原发肿瘤营养供给的同时,也能减轻肿瘤细胞的远处转移。VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)是促进血管形成的关键分子,抗VEGF的靶向药物贝伐珠单抗(Bevacizumab)已广泛应用于临床肿瘤的治疗,但是随着耐药现象出现以及缺氧诱导其它促血管生成因子增加,如Angptl4(Angiopoietin-like4)、IL-8(Interleukin-8)、EPO(Erythropoietin)等,病人的治疗效果及预后并未得到明显的改善。因此从缺氧角度出发探究乳腺癌血管形成机制尤为重要。缺氧是肿瘤微环境中的重要特征,其中缺氧诱导因子1 alpha(HIF-1α)在促进肿瘤新血管形成中发挥重要的调控作用。HIF-1α诱导肿瘤细胞产生大量的促血管生长因子及激活血管形成的相关通路,如VEGF、Angptl4、EPO、IL-8、TGF-β(Transforming Growth Factor β)、NF-KB,其中以VEGFA作用最为明显。大量的促血管生成因子的出现,使得肿瘤组织中内皮细胞异常增生,形成紊乱无序且具有高渗透性的新生血管,导致肿瘤细胞迅速增殖且发生血行转移。因此,抑制缺氧环境中肿瘤细胞HIF-1α基因表达,将有效地减少肿瘤内新生血管形成。Sohlh2(Spermatogenesis and oogenesis basic helix-loop-helix transcription factor 2)是碱性螺旋-环-螺旋家族中重要的转录因子,可通过与靶基因启动子的E box序列(CANNTG)结合,调控细胞的增殖、迁移、分化等多种细胞行为。Sohlh2广泛存在人体各器官组织中,如乳腺、卵巢、结肠、肾脏等,但是在各脏器对应的肿瘤组织中表达量却明显降低。前期实验已证实sohlh2是一个新的抑癌基因,可以抑制乳腺癌、卵巢癌、结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和远处转移。RNA高通量测序结果显示,敲减sohlh2可促进乳腺癌细胞HIF-1α及血管生成相关因子VEGF、IL-8等的表达。我们提出假设,sohlh2可能通过抑制HIF-1α信号通路参与乳腺癌血管形成的调控。选取30例乳腺导管癌患者病理切片,免疫组化染色检测sohlh2与血管相关蛋白(CD31、CD34)在乳腺癌组织标本中的表达,分析sohlh2表达与微血管密度(Microvessel density)的相关性。实验结果显示,乳腺癌组织中sohlh2蛋白表达与MVD存在显著的负相关,结果提示sohlh2可能抑制乳腺癌的血管形成。肿瘤血管形成在很大程度上依赖于肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用。通过慢病毒转染的方式,构建过表达sohlh2或敲减sohlh2的稳转乳腺癌细胞系;通过构建乳腺癌细胞-内皮细胞共培养体系或收集乳腺癌细胞条件培养基的方式,体外模拟肿瘤微环境,旨在探究sohlh2是否通过调控肿瘤细胞血管生成相关细胞因子的分泌,影响血管内皮细胞功能;另外通过q-PCR、Western-blot、CHIP、Luciferase Report Assay、免疫荧光、免疫组化、裸鼠原位成瘤等实验技术,探究sohlh2对于HIF-1α及下游促血管形成因子的调控及其机制,以期为临床抗血管治疗提供新的思路。研究方法1.研究乳腺癌组织中sohlh2与MVD、临床特征的相关性选取30例乳腺导管癌患者肿瘤组织标本,免疫组化染色分析乳腺癌组织中sohlh2蛋白水平与MVD的相关性;结合患者临床特征信息,分析sohlh2基因表达与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、ER(+)、PR(+)、远处转移的相关性。2.研究soh Ih2是否通过肿瘤细胞旁分泌途径调控血管内皮细胞功能选取人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、MCF-7),通过慢病毒转染的方式构建稳转细胞系,分为以下四组:①MDA-MB-231 con②MDA-MB-23]sohlh2③MCF-7 si-con④MCF-7 si-sohlh2。通过构建共培养体系或收集条件培养基,将稳转乳腺癌细胞与人脐静脉内皮细胞HUVEC相互作用,通过CCK-8、FACS、Transwell迁移、基质胶小管形成等实验方法,研究sohlh2是否通过肿瘤细胞旁分泌途径调控血管内皮细胞功能。3.在体实验研究sohlh2在乳腺癌血管形成中的作用16只雌性Balbc裸鼠随机分为4组,于右侧乳房脂肪垫原位注射上述四组乳腺癌细胞,测量肿瘤大小,绘制生长曲线。4周后,剥离原位瘤体,拍照、称重,进行CD31、CD34免疫组化染色,在体实验研究sohlh2对乳腺癌原位瘤体的生长、血管形成的影响。4.研究soh I h2是否通过调控HIF-1 a及其相关的促血管生长因子表达,调控乳腺癌血管形成在乳腺癌细胞系与裸鼠原位瘤体中,通过q-PCR、Western-blot、ELISA、免疫荧光、免疫组化等实验方法,检测sohlh2对于乳腺癌细胞HIF-1α、VEGFA、Angptl4 的mRNA和蛋白表达的影响;通过CHIP、Luciferase Report Assay等实验技术,检测sohlh2是否直接调控HIF-1α转录;利用乏氧剂氯化钴诱导缺氧模型或给予HIF-1α的阻断剂KC2F7,进一步研究HIF-1α是否介导sohlh2抑制乳腺癌血管形成的作用。5.研究临床乳腺癌样本中,soh I h2与HI F-1 α及其促血管生长因子的相关性免疫组化染色,观察sohlh2与HIF-1α、VEGFA、Angpt14蛋白表达的相关性,spearman分析计算相关系数。研究结果1.临床乳腺癌组织免疫组化染色结果显示:在sohlh2高表达的乳腺癌样本中,CD31、CD34呈明显低表达;而在sohlh2低表达的乳腺癌样本中,CD31、CD34呈高表达。绘制散点图,spearman相关分析系数分别为-0.769和-0.708,sohlh2与CD31、CD34表达呈显著负相关;分析患者临床特征信息,结果显示sohlh2表达量与年龄、ER(+)、PR(+)无显著性差异,而与肿瘤大小、组织学分级、远处转移呈负相关。2.CCK-8、Transwell迁移结果显示:sohlh2阻断肿瘤细胞旁分泌对血管内皮细胞增殖、迁移的促进作用,敲减sohlh2作用相反;FACS测凋亡结果证实sohlh2通过肿瘤旁分泌途径促进内皮细胞的凋亡,敲减sohlh2作用相反;基质胶小管形成实验结果显示:sohlh2抑制条件培养基对于内皮细胞小管形成的诱导作用,敲减sohlh2则作用相反。3.ELISA结果示:sohlh2抑制肿瘤细胞分泌VEGFA、Angptl4,敲减sohlh2则促进VEGFA的分泌,尤以对VEGFA影响最为显著。4.裸鼠成瘤实验结果示:sohlh2抑制乳腺原位瘤体的生长,敲减sohlh2则促进原位瘤体的生长。免疫组化结果示:与MDA-MB-231 con组相比,MDA-MB-231 sohlh2组的CD31、CD34表达量明显降低,肿瘤组织血管较少;与MCF-7 si-sohlh2组比较,MCF-7 si-sohlh2组的CD31、CD34表达量明显降低,肿瘤组织血管较多。5.乳腺癌细胞系中,q-PCR、Western-blot结果示:sohlh2抑制HIF-1α、VEGFA、Angptl4的mRNA和蛋白水平的表达,敲减sohlh2则促进HIF-1 α、VEGFA、Angptl4 mRNA和蛋白水平的表达。免疫荧光结果示:sohlh2抑制胞核中HIF-1α的表达,敲减sohlh2胞核中HIF-1 α的表达量明显升高;sohlh2抑制胞质中VEGFA、Angpt14的表达,敲减sohlh2胞质中VEGFA、Angptl4明显升高。6.裸鼠瘤体组织中,q-PCR、Western-blot结果示:sohlh2抑制HIF-1α、VEGFA、Angptl4的mRNA和蛋白水平的表达,敲减sohlh2作用相反;免疫组化进一步证实sohlh2抑制瘤体组织中HIF-1α、VEGFA、Angptl4蛋白的表达,敲减sohlh2后,HIF-1α、VEGFA、Angptl4蛋白表达量明显升高。7.CHIP、Luciferase Report Assay结果显示:sohlh2可以结合到HIF-1α的启动子区域并抑制其转录,敲减sohlh2则作用相反;氯化钴诱导缺氧模型结果示:HIF-1α可以在一定程度上逆转sohlh2对于小管形成的抑制作用,且能够部分阻断sohlh2对于VEGFA、Angpt14表达的下调作用;给予KC2F7处理,抑制HIF-1α下游通路,结果示:KC2F7可明显减弱sohlh2 RNAi对于小管形成的促进作用,以及对于VEGFA、Angpt14表达的上调作用。8.在临床乳腺癌病理切片中,免疫组化染色检测sohlh2与HIF-1α、VEGFA、Angpt14的表达。结果显示,sohlh2高表达的乳腺癌样本中,HIF-1α、VEGFA、Angpt14呈低表达;而在sohlh2低表达的乳腺癌标本中,HIF-1α、VEGFA、Angpt14呈高表达。Sperαmαn相关分析进一步证实sohlh2与HIF-1α、VEGFA、Angpt14呈明显的负相关。结论1.Sohlh2通过肿瘤细胞旁分泌途径调控血管内皮细胞功能;2..Sohlh2通过抑制HIF-1α的转录调控乳腺癌血管形成。