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[目的]
人胰高血糖素样肽-1(human glucagon-like peptide-1,hGLP-1)是一种由30个氨基酸残基组成的肠促胰岛素激素,主要由肠道L细胞分泌,具有促进胰岛素分泌、降低血糖的作用。同时,对胰岛β细胞的分化、增殖也起重要作用,包括抑制β细胞凋亡。本课题组通过前期研究,已建立了一整套采用基因工程方法制备重组hGLP-1的技术路线,获得了具有生物学活性的重组hGLP-1产物。但由于其较短的生物半衰期及多肽药物口服给药的限制,本实验研究拟构建一种新型hGLP-1类似物基因,并将该基因克隆入真核表达载体,通过体内外实验研究其在糖尿病治疗中的作用,为hGLP-1用于糖尿病基因治疗提供实验资料。
[方法]
1.采用固相亚磷酸三酯法分段合成hGLP-1类似物基因片段,退火拼接成完整的2×Val2-hGLP-1类似物基因,插入pBS SK(+/-)克隆载体,构建重组质粒pBS SK(+/-)/2×Val2-hGLP-1,经双酶切鉴定和序列分析,将2×Val2-hGLP-1类似物基因克隆至真核表达载体,构建plRES2-EGFP/2×Val2-hGLP-1真核表达载体。
2.采用脂质体转染将真核表达载体plRES2-EGFP/2×Val2-hGLP-1导入HEK-293细胞,Western blotting检测hGLP-1类似物在HEK-293细胞中的表达。
3.借助脂质体将plRES2.EGFP/2×Val2-hGLP-1转染入四氧嘧啶(AXN)诱导凋亡的β-TC-6胰岛瘤细胞株,通过WST-1实验和Hochest染色初步观察其对胰岛细胞凋亡的影响。
4.腹腔注射STZ制备糖尿病大鼠模型,通过尾静脉注射plRES2-EGFP/2×Val2-hGLP-1重组表达载体,分析其对糖尿病大鼠的干预作用。
[结果]
1.构建的pBS SK(+/-)/2×Val2-hGLP-1克隆载体和真核表达载体pIRES2-EGFP/2×Val2-hGLP-1经DNA测序,证实2×Val2-hGLP-1基因正确插入表达载体中。
2.Western blotting分析表明,Val2-hGLP-1在HEK-293细胞中成功表达。
3.AXN诱导β-TC-6胰岛瘤细胞凋亡,WST-1实验和Hochest染色初步证明pIRES2-EGFP/2×Val2-hGLP-1基因转染对胰岛瘤细胞凋亡具有抑制作用。
4.STZ成功诱导SD糖尿病大鼠模型,尾静脉注射pIRES2-EGFP/2×Val2-hGLP-1重组载体后,免疫组化证实hGLP-1类似物在大鼠体内成功表达,并随血流输送至靶器官发挥作用,糖尿病大鼠的生活状态、饮水、进食量、体重、血糖、血清胰岛素、总胆固醇水平明显改善,糖耐量提高。HE染色发现胰岛病理状况明显改善,免疫组化观察发现胰岛素分泌颗粒增多。
[结论]
成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/2×Val2-hGLP-1,Western blotting证实hGLP-1类似物基因能成功表达于HEK-293细胞中。2×Val2-hGLP-1基因转染在AXN诱导凋亡的β-TC-6细胞株中发挥抑凋亡作用。hGLP-1类似物基因转染对糖尿病大鼠的机体代谢具有良好的调节作用,缓解了糖尿病大鼠的代谢症状,而且糖尿病大鼠的胰岛素分泌增加、胰岛β细胞增殖。