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目的:
了解牛膝多肽加入不同时间后对原代培养及在体坐骨神经缺损修复时施万细胞增殖功能的促进作用，并探讨牛膝多肽促施万细胞增殖过程的作用机制及关键调控基因，进一步研究牛膝多肽对施万细胞的整体作用及机制分析，有助于周围神经损伤治疗靶点的探寻，为牛膝多肽用于临床治疗周围神经损伤提供更有针对性的思路。
方法:
1.体外培养原代施万细胞。分别加入完全培养基(Control组)、含牛膝多肽的完全培养基(ABPPk组)、含NGF的完全培养基(NGF组)，分别于加入后不同时间点(15min、0.5h、1h、2h、3h、6h、12h、24h)，通过CCK8、细胞周期检测、EdU增殖检测、细胞增殖核抗原(PCNA、Ki67)的蛋白及免疫荧光检测等方法确定施万细胞的增殖变化。
2.制备大鼠坐骨神经夹伤模型。大鼠坐骨神经夹伤后，分别在损伤神经外膜下显微注射生理盐水(Control组)、含牛膝多肽的生理盐水(ABPPk组)、含NGF的生理盐水(NGF组)，于术后不同时间点(1d、4d、7d)取大鼠损伤段坐骨神经，通过Westernblot及冰冻切片-免疫组化-光镜观察施万细胞增殖情况及神经形态变化。
3.全转录组测序及施万细胞增殖调控机制分析。体外原代培养的施万细胞分别于加入完全培养基(Control组)、含牛膝多肽的完全培养基(ABPPk组)、含NGF的完全培养基(NGF组)后，分别于加入后15min、0.5h、1h、2h、3h、6h、12h、24h不同时间点获得各组细胞，进行全转录组测序，通过生物信息学分析工具分别对Control组、ABPPk组及NGF组所有时间点的施万细胞增殖功能相关基因进行聚类分析及蛋白互作网络分析，比较ABPPk与NGF促进施万细胞增殖作用机制的异同点;通过IPA数据库对施万细胞增殖功能相关基因进行分析，进一步结合miRNA及lncRNA数据进行ceRNA网络调控分析。
4.ABPPk对施万细胞的作用及调控机制研究。对全转录组测序结果进行进一步生物信息学分析，通过IPA数据库对ABPPk组及NGF组的数据进行CanonicalPathway以及DiseaseFunction的各个时间点的比较分析、Cluster聚类分析及GO分析，并通络IPA数据库对施万细胞不同功能(施万细胞迁移、分化及成髓鞘等)进行分析，并对所有时间点进行WGCNA分析，比较ABPPk与NGF的作用机制异同点，寻找ABPPk与NGF作用的关键功能基因。
结果:
1.体外研究结果显示，ABPPk可以有效促进原代施万细胞增殖。ABPPk加入后出现明显的细胞周期改变、EdU染色增多、PCNA及Ki67蛋白表达增加。
2.体内研究结果显示，ABPPk可以明显增加大鼠坐骨神经损伤段的施万细胞增殖，并且随着时间延长，这种施万细胞增殖现象愈加明显。
3.全转录组测序及对施万细胞增殖功能相关基因进行生物信息学分析结果显示，ABPPk组早期15min主要有Pmp22、Mmp9、Egr2、Lama2及Gdnf等基因介导施万细胞增殖作用，而NGF组早期15rmin正调控的基因较少，主要有Pmp22、Egr2、Erbb2及Cnd4等;0.5h～3h两组高表达的基因还是有一定的相同点;12h时两组基因均以负调控为主;24h时又都有很多基因恢复正调控，ABPPk组主要有Ccnd3、Lama2、Nrg1、Sdc3、Cdc42等，而NGF组主要有Erbb2、Cnd4、Rnf10、Ccnd3、Sdc3、Cdc42等。
4.Comparsionanalysis分析结果显示，ABPPk组主要参与ProteinKinaseASignaling，NF-κBSignaling，mTORSignaling，IntegrinSignaling等信号通路，以及与分子转运、轴突生长、神经传递、细胞运动、突触传递等功能密切相关，并且随着时间的推移不断变化。而NGF组主要参与IL-8Signaling，CREBSignalinginNeurons，IntegrinSignaling，EphrinReceptorSignaling等信号通路，并且主要与细胞运动及迁移、分子转运、突触传递、神经传递等功能密切相关，随着时间的推移不断变化。比较发现ABPPk组与NGF组主要参与的信号通路有很大的不同，而在生物学功能上有一些相同的功能，但相同的生物学功能在不同时间点发挥的作用也不一样。
5.Cluster聚类分析发现，ABPPk组早期主要有Unc5b、Tecpr1、Paqr4、Mrc2及Sgk1等基因高表达，起早期调控作用，24h时有一个区域的基因出现比较强烈的高表达，主要包括Pmnl3、Commd2、Erbb2、Prx、Vasp及Nrg1等基因。而NGF组出现基因高表达的区域与ABPPk组有很大的不同，早期高表达基因比较分散，24h时也有一个区域的基因出现比较强烈的高表达，主要包括Mtfr2、Dock7、Usp1、Vps16等基因。
6.GO分析结果显示，ABPPk组早期主要参与的功能有vascularendothelialgrowthfactorproduction,responsetoATP,positiveregulationofaxonextension等;中期主要参与neuromuscularjunctiondevelopment，regulationofaxonextension，bloodvessellumenization，negativeregulationofneurondeath等生物学过程;后期主要参与的功能有regulationoftissueremodeling，regulationofshort-termneuronalsynapticplasticity,neuronprojectionextension,negativeregulationofdendriticcellapoptoticprocess等。NGF组早期主要参与的功能有neurotrophinsignalingpathway，responsetoATP，positiveregulationofaxonextension等;中期主要参与的功能有regulationofmyelination,neurotransmitterreceptorbiosyntheticprocess,neuronprojectionmorphogenesis,negativeregulationofneurondeath,positiveregulationofneurondifferentiation等;后期主要参与的功能有axonensheathment，negativeregulationofdendriticcellapoptoticprocess,glialcellfatecommitment,positiveregulationofdendritemorphogenesis等。
7.施万细胞不同生物学过程分析结果显示，施万细胞迁移功能相关的46个基因中，ABPPk组与NGF组均主要与Rac1、Vegfa、Pmp22、Bdnf、Pxn等基因密切相关;施万细胞分化功能相关的33个基因中，早期ABPPk组通过Egr2介导，而NGF组通过Igf1基因介导，两组主要均有Dock7、Lamc1、Nrg1等基因密切相关。成髓鞘功能相关基因共266个，ABPPk组与NGF组在这个过程中均有很多基因参与其中，如Rxrb、Sgk1、Gabbr1、Cntn1基因等，均在两组中多个时间点特异性表达，但是两组中每个时间点的基因表达还是有很大的不同。
8.WGCNA结果显示，ABPPk组主要与组蛋白去甲基促进转录、应对缺血、ABC转运蛋白促进物质交换、正调控细胞增殖、细胞增殖表观调控、核糖体生物发生增多、防御信号、WNT通路调控等功能模块密切相关;NGF组主要与G蛋白偶联的信号转导、细胞增殖负调控下行、细胞周期正调控、、核糖体组分、糖稳态、鞘脂类信号通路激活、细胞分裂及可变剪接、PI3K等功能模块密切相关。
9.Real-timePCR及Westernblot结果显示，关键基因的检测结果与全转录组测序结果随着时间变化表达趋势相似，具有较好的相关性。免疫组化结果显示，关键调控基因在各组均有翻译表达并且和施万细胞共定位表达，表明其在ABPPk作用于施万细胞增殖过程中发挥作用。
结论:
1.ABPPk具有显著的促进施万细胞增殖作用，且与Erbb2、Pmp22、Nrg1、Foxo3、Egr2等基因密切相关;同时，参与施万细胞增殖的调控基因种类与NGF有一定程度的相似性，但作用时间有差别。
2.ABPPk与NGF作用于施万细胞，在不同阶段对于抑制神经元凋亡、促进轴突延伸、突触重塑等生物学过程均有调控作用;但较之NGF组，ABPPk组还参与血管管腔化及组织重塑的生物学过程调控。
了解牛膝多肽加入不同时间后对原代培养及在体坐骨神经缺损修复时施万细胞增殖功能的促进作用，并探讨牛膝多肽促施万细胞增殖过程的作用机制及关键调控基因，进一步研究牛膝多肽对施万细胞的整体作用及机制分析，有助于周围神经损伤治疗靶点的探寻，为牛膝多肽用于临床治疗周围神经损伤提供更有针对性的思路。
方法:
1.体外培养原代施万细胞。分别加入完全培养基(Control组)、含牛膝多肽的完全培养基(ABPPk组)、含NGF的完全培养基(NGF组)，分别于加入后不同时间点(15min、0.5h、1h、2h、3h、6h、12h、24h)，通过CCK8、细胞周期检测、EdU增殖检测、细胞增殖核抗原(PCNA、Ki67)的蛋白及免疫荧光检测等方法确定施万细胞的增殖变化。
2.制备大鼠坐骨神经夹伤模型。大鼠坐骨神经夹伤后，分别在损伤神经外膜下显微注射生理盐水(Control组)、含牛膝多肽的生理盐水(ABPPk组)、含NGF的生理盐水(NGF组)，于术后不同时间点(1d、4d、7d)取大鼠损伤段坐骨神经，通过Westernblot及冰冻切片-免疫组化-光镜观察施万细胞增殖情况及神经形态变化。
3.全转录组测序及施万细胞增殖调控机制分析。体外原代培养的施万细胞分别于加入完全培养基(Control组)、含牛膝多肽的完全培养基(ABPPk组)、含NGF的完全培养基(NGF组)后，分别于加入后15min、0.5h、1h、2h、3h、6h、12h、24h不同时间点获得各组细胞，进行全转录组测序，通过生物信息学分析工具分别对Control组、ABPPk组及NGF组所有时间点的施万细胞增殖功能相关基因进行聚类分析及蛋白互作网络分析，比较ABPPk与NGF促进施万细胞增殖作用机制的异同点;通过IPA数据库对施万细胞增殖功能相关基因进行分析，进一步结合miRNA及lncRNA数据进行ceRNA网络调控分析。
4.ABPPk对施万细胞的作用及调控机制研究。对全转录组测序结果进行进一步生物信息学分析，通过IPA数据库对ABPPk组及NGF组的数据进行CanonicalPathway以及DiseaseFunction的各个时间点的比较分析、Cluster聚类分析及GO分析，并通络IPA数据库对施万细胞不同功能(施万细胞迁移、分化及成髓鞘等)进行分析，并对所有时间点进行WGCNA分析，比较ABPPk与NGF的作用机制异同点，寻找ABPPk与NGF作用的关键功能基因。
结果:
1.体外研究结果显示，ABPPk可以有效促进原代施万细胞增殖。ABPPk加入后出现明显的细胞周期改变、EdU染色增多、PCNA及Ki67蛋白表达增加。
2.体内研究结果显示，ABPPk可以明显增加大鼠坐骨神经损伤段的施万细胞增殖，并且随着时间延长，这种施万细胞增殖现象愈加明显。
3.全转录组测序及对施万细胞增殖功能相关基因进行生物信息学分析结果显示，ABPPk组早期15min主要有Pmp22、Mmp9、Egr2、Lama2及Gdnf等基因介导施万细胞增殖作用，而NGF组早期15rmin正调控的基因较少，主要有Pmp22、Egr2、Erbb2及Cnd4等;0.5h～3h两组高表达的基因还是有一定的相同点;12h时两组基因均以负调控为主;24h时又都有很多基因恢复正调控，ABPPk组主要有Ccnd3、Lama2、Nrg1、Sdc3、Cdc42等，而NGF组主要有Erbb2、Cnd4、Rnf10、Ccnd3、Sdc3、Cdc42等。
4.Comparsionanalysis分析结果显示，ABPPk组主要参与ProteinKinaseASignaling，NF-κBSignaling，mTORSignaling，IntegrinSignaling等信号通路，以及与分子转运、轴突生长、神经传递、细胞运动、突触传递等功能密切相关，并且随着时间的推移不断变化。而NGF组主要参与IL-8Signaling，CREBSignalinginNeurons，IntegrinSignaling，EphrinReceptorSignaling等信号通路，并且主要与细胞运动及迁移、分子转运、突触传递、神经传递等功能密切相关，随着时间的推移不断变化。比较发现ABPPk组与NGF组主要参与的信号通路有很大的不同，而在生物学功能上有一些相同的功能，但相同的生物学功能在不同时间点发挥的作用也不一样。
5.Cluster聚类分析发现，ABPPk组早期主要有Unc5b、Tecpr1、Paqr4、Mrc2及Sgk1等基因高表达，起早期调控作用，24h时有一个区域的基因出现比较强烈的高表达，主要包括Pmnl3、Commd2、Erbb2、Prx、Vasp及Nrg1等基因。而NGF组出现基因高表达的区域与ABPPk组有很大的不同，早期高表达基因比较分散，24h时也有一个区域的基因出现比较强烈的高表达，主要包括Mtfr2、Dock7、Usp1、Vps16等基因。
6.GO分析结果显示，ABPPk组早期主要参与的功能有vascularendothelialgrowthfactorproduction,responsetoATP,positiveregulationofaxonextension等;中期主要参与neuromuscularjunctiondevelopment，regulationofaxonextension，bloodvessellumenization，negativeregulationofneurondeath等生物学过程;后期主要参与的功能有regulationoftissueremodeling，regulationofshort-termneuronalsynapticplasticity,neuronprojectionextension,negativeregulationofdendriticcellapoptoticprocess等。NGF组早期主要参与的功能有neurotrophinsignalingpathway，responsetoATP，positiveregulationofaxonextension等;中期主要参与的功能有regulationofmyelination,neurotransmitterreceptorbiosyntheticprocess,neuronprojectionmorphogenesis,negativeregulationofneurondeath,positiveregulationofneurondifferentiation等;后期主要参与的功能有axonensheathment，negativeregulationofdendriticcellapoptoticprocess,glialcellfatecommitment,positiveregulationofdendritemorphogenesis等。
7.施万细胞不同生物学过程分析结果显示，施万细胞迁移功能相关的46个基因中，ABPPk组与NGF组均主要与Rac1、Vegfa、Pmp22、Bdnf、Pxn等基因密切相关;施万细胞分化功能相关的33个基因中，早期ABPPk组通过Egr2介导，而NGF组通过Igf1基因介导，两组主要均有Dock7、Lamc1、Nrg1等基因密切相关。成髓鞘功能相关基因共266个，ABPPk组与NGF组在这个过程中均有很多基因参与其中，如Rxrb、Sgk1、Gabbr1、Cntn1基因等，均在两组中多个时间点特异性表达，但是两组中每个时间点的基因表达还是有很大的不同。
8.WGCNA结果显示，ABPPk组主要与组蛋白去甲基促进转录、应对缺血、ABC转运蛋白促进物质交换、正调控细胞增殖、细胞增殖表观调控、核糖体生物发生增多、防御信号、WNT通路调控等功能模块密切相关;NGF组主要与G蛋白偶联的信号转导、细胞增殖负调控下行、细胞周期正调控、、核糖体组分、糖稳态、鞘脂类信号通路激活、细胞分裂及可变剪接、PI3K等功能模块密切相关。
9.Real-timePCR及Westernblot结果显示，关键基因的检测结果与全转录组测序结果随着时间变化表达趋势相似，具有较好的相关性。免疫组化结果显示，关键调控基因在各组均有翻译表达并且和施万细胞共定位表达，表明其在ABPPk作用于施万细胞增殖过程中发挥作用。
结论:
1.ABPPk具有显著的促进施万细胞增殖作用，且与Erbb2、Pmp22、Nrg1、Foxo3、Egr2等基因密切相关;同时，参与施万细胞增殖的调控基因种类与NGF有一定程度的相似性，但作用时间有差别。
2.ABPPk与NGF作用于施万细胞，在不同阶段对于抑制神经元凋亡、促进轴突延伸、突触重塑等生物学过程均有调控作用;但较之NGF组，ABPPk组还参与血管管腔化及组织重塑的生物学过程调控。