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L-高苯丙氨酸(L-HPA)及其酯是用来制备血管紧张素(ACE)抑制剂类药物的重要原料。它是目前世界上约20种抗高血压新药的共同中间体,可以直接用于制造依那普利、贝那普利、赖诺普利、地拉普利等。目前,L-高苯丙氨酸及其酯的市场需求大增。现行制备L-HPA的方法主要是化学合成法,条件苛刻。在全面分析和总结文献及现有研究的基础上,本文选择以苯丙酸乙酯为原料采用化学法合成2-氧代-4-苯基丁酸,随后以此为原料通过固定化细胞催化转化制L-HPA。
本文主要成果及技术创新如下:
1)2-氧代-4-苯基丁酸的制备。分析了苯丙酸乙酯和草酸二乙酯制备2-氧代-4-苯基丁酸的工艺过程。用正交实验法对工艺进行了综合优化,得到最佳工艺条件为:n(苯丙酸乙酯):n(草酸二乙酯)=1:3,缩合反应时间2.5 h;H2SO4的质量浓度为20%,水解时间15 h,2-OPBA产率68.24%。从极差分析得知,苯丙酸乙酯与草酸二乙酯物质的量比和水解时间对实验结果影响最大。
2)以聚乙烯醇为载体固定化E coli A5细胞并研究其性质。得到了活性高,稳定性好的固定化细胞。固定化细胞的最佳制备条件为:PVA浓度10%,海藻酸钠0.2%,交联剂为硼砂12.5 g·L-1,硼酸15 g·L-1,氯化钙10 g·L-1,氯化钠50 g·L-1,菌体量为0.30 g·mL-1。加入吸附性填充物活性碳,固定化细胞的机械强度,韧性,细胞流失都显著改善,稳定性大大提高。最佳条件制备得到的固定化细胞,改善了聚乙烯醇凝胶的吸水膨胀性。并且考察固定化细胞的操作稳定性。在批次实验中,经过14个批次的操作后,其产率为初始的77.7%。在连续实验中,经过连续操作30天后活性仍保持稳定,其平均转化率均在75%以上。固定化细胞膨胀率小,未有破碎现象,填充床反应器不堵塞。
3)以2-氧代-4-苯基丁酸为原料,通过固定化细胞催化制备L-HPA。首先考察了L-HPA在不同pH下的溶解度和形态对固定化细胞催化的生物转化过程的影响,并以此性质为出发点,研究了L-HPA的制备。最佳的反应条件为:pH为8.5,最适温度为40℃,底物浓度为10 g·L-1细胞浓度为3%,采用廉价的L-Glu作为氨基供体。由于L-HPA在反应条件下的低溶解度,促使反应平衡朝产物方向进行,产物的产率最高可达91.7%。考察了在此条件下固定化细胞的操作稳定性,其半衰期为16个批次,较其它方法大幅提高。考察了表面活性剂对晶体形态和细胞活力的影响。添加了0.4%的非离子型表面活性剂Tween-80,得到微细的L-HPA晶体颗粒,从而降低固定化颗粒对产物的吸附作用,显著提高其传质过程效率,而Tween-80对固定化细胞的活力影响不大。根据溶解度的性质,通过调节pH对其进行分离,产品纯度≥98%。