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猪δ冠状病毒（PDCoV）是近年来新发现的一种冠状病毒,临床上主要感染仔猪,引起仔猪严重的肠炎并伴有水样腹泻和呕吐等症状,和猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的临床症状极为相似,且临床上PDCoV和TGEV、PEDV混合感染时有发生,给养猪业造成了巨大的经济损失。迄今为止,尚未有PDCoV诊断和预防的商用试剂和疫苗,因此关于PDCoV诊断方法和疫苗的研究迫在眉睫。冠状病毒N蛋白是一种磷酸化的多功能结构蛋白,在冠状病毒四个结构蛋白中最保守,且是在感染细胞中表达最多的结构蛋白。利用这些特性,N蛋白常用于建立冠状病毒的快速、高效、准确的血清学诊断方法。本试验以PDCoV N蛋白为靶蛋白进行了原核表达与蛋白纯化,并将N蛋白免疫新西兰大白兔制备了多克隆血清,建立了PDCoV血清学诊断方法,并进行了初步应用。具体研究如下:1.PDCoV N蛋白的原核表达与纯化根据GenBank收录的PDCoV HKU15-44株的N基因序列,设计一对扩增N全基因的引物,以重组质粒PMD18-T-PDCoV-N为模板,用PCR方法扩增出N全基因片段,将此片段克隆至原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,此重组质粒经双酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌BL21,通过对IPTG诱导浓度和诱导时间的优化后,成功获得了大小约为42.9kDa的重组N蛋白,该重组N蛋白大部分以可溶性蛋白形式存在,应用镍柱纯化试剂盒对其进行纯化后,Western blot证实该重组N蛋白具有良好的反应原性。该重组N蛋白可作为制备多克隆血清的抗原和间接ELISA方法的包被抗原。2.PDCoV N蛋白多克隆抗体的制备及应用将纯化的重组N蛋白与弗氏佐剂乳化后,免疫注射新西兰大白兔三次后,获得了兔抗重组PDCoV N蛋白的多克隆血清。Western blot测定该多克隆血清能和原核表达纯化的重组N蛋白发生特异性反应,血清效价为1:12000,同时以PDCoV全病毒作为包被抗原后,应用间接ELISA方法测定该多克隆血清的效价为1:12800,表明制备的兔多克隆血清具有较好的特异性。PDCoV感染ST细胞后,用兔多克隆血清（1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000稀释）作为一抗进行间接免疫荧光试验,结果显示该抗体可以识别细胞中的PDCoV,且多抗血清的最佳稀释比例为1:200,说明所制备的多克隆血清能够用于间接免疫荧光试验检测PDCoV抗原。3.PDCoV N蛋白间接ELISA方法的建立及初步应用以重组N蛋白作为包被抗原,PDCoV标准阳性血清为一抗,HRP标记的兔抗猪IgG为二抗,通过优化反应条件,建立了检测PDCoV抗体的间接ELISA方法。其中重组N蛋白作为包被抗原的浓度是2μg/mL,4℃包被过夜,最佳封闭条件为1%BSA 37℃封闭2h,血清（80倍稀释）37℃作用1h,二抗6000倍稀释后37℃作用1h,底物TMB 37℃显色15min。应用建立的间接ELISA方法检测猪临床血清,选取其中40份OD450值较低的血清,且以其平均值加上3倍的标准差（X+3SD）为阴阳性血清临界值,确定PDCoV阴阳性血清的临界值为OD450=0.272。特异性试验证实该方法具有良好的特异性,不与其他病毒（猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒）的抗体产生交叉反应。批内重复试验和批间重复试验变异系数均小于5%,表明建立的间接ELISA方法具有很好的重复性和稳定性。应用建立的间接ELISA方法对来自河南各地市猪场送检的165份临床猪血清进行检测,检出PDCoV抗体阳性样品89份,阳性率为53.93%,随机抽取10份OD450值低于或稍高于0.272的临床猪血清,进行间接免疫荧光试验,结果显示OD450值低于0.272的猪血清为PDCoV抗体阴性,稍高于0.272的猪血清为PDCoV抗体阳性,说明建立的ELISA方法具有较高的准确性。综述所述,本试验建立的间接ELISA方法可用于猪血清中PDCoV抗体的检测,为临床上猪群中PDCoV感染的血清流行病学调查提供了确实可行的技术手段。