目的米非司酮(Mifepristone,RU486)是由人工合成的一种19-去甲类固醇激素,能够有效的和孕酮受体、糖皮质激素受体结合,并对上述激素有很强的拮抗作用,是临床上一种常见的甾体类抗孕激素药物。近期研究发现,米非司酮对肿瘤的生长有较好的抑制作用,而其对孕酮和糖皮质激素拮抗效应也受到了广泛关注。然而,米非司酮对肿瘤的作用机制仍存在很大的争论。正常体内孕酮激素和糖皮质激素合成在线粒体完成,原料为胆固醇,通过线粒体膜表面的18 kDa转位分子蛋白(18 kDa translocator protein,TSPO),转运至线粒体内,合成孕酮和糖皮质激素。此过程中,TSPO的数量和活性对于孕酮和糖皮质激素合成起到至关重要的作用,反过来,体内孕酮和糖皮质激素浓度对TSPO也存在负反馈作用,即孕酮和糖皮质激素浓度高,负反馈调节TSPO表达下降,活性降低,从而减少胆固醇运输,减少孕酮和糖皮质激素合成,反之亦然。TSPO是线粒体凋亡途径(Mitochondrial apoptosis pathway)中关键调节蛋白,激活后可通过启动细胞凋亡,在肿瘤生长过程中发挥抑制作用。因此,本研究的假说为:米非司酮通过抑制孕酮和糖皮质激素活性,减少孕酮和糖皮质激素对TSPO负反馈作用,增加TSPO表达及活性,通过线粒体凋亡途径,增加细胞凋亡,抑制肿瘤生长。本实验通过米非司酮对人脑胶质瘤细胞系U251体外实验研究,探讨米非司酮是否对U251细胞株具有抑制细胞增殖活性作用,并观察米非司酮对U251细胞凋亡的影响和TSPO、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的变化,初步探讨米非司酮诱导U251细胞凋亡的相关作用机制,为新型抗肿瘤药物研发提供基础实验依据。方法第一部分使用CCK-8微板比色法检测不同浓度的米非司酮(2.5、5、10、20、40μmol/L)组中U251细胞活性,台盼兰染色法检测细胞死亡率。第二部分根据第一部分的实验结果,选取米非司酮5、10、20 umol/L三个浓度组,通过Hoechst33258染色、流式细胞仪检测U251细胞凋亡,采用蛋白印迹法和免疫荧光染色法检测U251细胞中TSPO,Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡相关蛋白表达。结果第一部分细胞活性检测结果显示:与对照组比较,5、10、20、40(μmol/L)米非司酮组细胞存活率明显降低,且与药物浓度成正比,有统计学意义(P<0.05)。低浓度米非司酮(2.5μmol/L)组对细胞存活率影响不明显,与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。死亡细胞检测结果显示:米非司酮组U251细胞死亡率较对照组均有所增加,且与药物浓度成正比。但当米非司酮浓度增加至20、40μmol/L时,各组间抑制作用已无明显差异。第二部分细胞凋亡检测显示,与对照组相比,米非司酮组细胞凋亡率增加明显,且一定范围内与药物浓度成正比,其中10μmol/L米非司酮浓度组TSPO的表达增加最明显(P<0.05)。凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3在米非司酮各浓度组中均有表达,其中20μmol/L浓度组Bcl-2蛋白表达明显低于对照组(P<0.05),而Bax、Caspase-3蛋白表达在20μmol/L浓度组中明显高于对照组(P<0.05)。结论(1)米非司酮在适当浓度范围内对胶质瘤U251细胞有增殖抑制作用,促进细胞凋亡的作用;(2)米非司酮对胶质瘤U251细胞有促凋亡作用,其机制可能与促进TSPO表达,启动线粒体凋亡途径有关。