吡啶甲酸铬对鸡胚成纤维细胞活性的氧化损伤作用及机制研究

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铬作为人和哺乳动物的一种必需微量营养素已为人们所熟知,三价铬通过葡萄糖耐量因子(GTF)协同作用和增强胰岛素的敏感性的作用来影响脂类、糖类、蛋白质和核酸的代谢。当前,三价铬制剂已广泛的应用于人的保健品、医药和食品中。从20世纪90年代,三价铬在动物营养中的作用越来越受重视和关注。作为营养添加剂,吡啶甲酸铬(Crpic)已经得到广泛的应用。但自从1995年Stearns首次报道吡啶甲酸铬的细胞毒性后,其安全问题就成为了研究的热点。迄今为止,对吡啶甲酸铬的安全性研究已得到一些数据,但结论不尽相同。虽然一些国家已批准吡啶甲酸铬在畜禽日粮中的添加,但目前尚未正式发布动物的最低需要量和最高耐受量。迄今关于吡啶甲酸铬毒性的体外试验主要集中在人、鼠的研究中,而吡啶甲酸铬对禽类是否存在损伤作用尚无相关研究。通过体外细胞培养试验,研究不同浓度吡啶甲酸铬对鸡胚成纤维细胞细胞生长的影响,旨在对吡啶甲酸铬的合理利用提供理论依据。本研究用9~11日龄的鸡胚制备鸡胚成纤维细胞,经两次传代后,在第三代鸡胚成纤维细胞换用含有吡啶甲酸铬终浓度为分别0,8,16,160,400,600μM的培养液共同培养,分别在培养24,48,72h后,采用MTT法检测其细胞活性;同时选取在吡啶甲酸铬与鸡胚成纤维细胞共同孵育48h时,运用荧光染色进行形态学检测,流式细胞仪进行细胞内活性氧、细胞内钙离子水平、细胞线粒体膜电位的变化以及细胞凋亡率的测定;用比色法测定细胞内抗氧化酶活性及谷胱甘肽与丙二醛的含量,以此来评价吡啶甲酸铬对鸡胚成纤维细胞活性的影响。结果显示,通过形态学分析和生化分析,吡啶甲酸铬在浓度400μM及以上对鸡胚成纤维细胞有毒性作用,而其他浓度组无明显影响。细胞活力的测定表明吡啶甲酸铬诱导细胞死亡存在剂量-时间关系,并在400μM及以上影响显著高于对照组;在高浓度下(400μM,600μM)通过形态学观察,细胞形态改变,出现染色质凝聚和凋亡小体,且细胞凋亡率极显著高于对照组,在8μM,16μM,160μM浓度组影响不显著;在160μM、400μM和600μM浓度组,细胞内活性氧状态改变且水平显著升高(P<0.01),细胞内钙离子水平显著升高(P<0.01),细胞线粒体细胞膜电位显著降低(P<0.01),而在低浓度(8μM,16μM)不显著;在8μM,16μM浓度组细胞内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶活性及谷胱甘肽与对照组相比稍有增高或无显著差异,而160μM、400μM、600μM均降低或显著降低(P<0.01),丙二醛含量在8μM,16μM和160μM浓度下与对照组相比无明显差异,而400μM,600μM时显著或极显著增高(P<0.01)。通过此实验得出,吡啶甲酸铬能够改变鸡胚成纤维细胞的氧化状态,诱导细胞死亡且存在剂量-时间关系,高浓度的吡啶甲酸铬可能通过氧化损伤和线粒体功能障碍来诱导细胞凋亡。
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