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研究背景及目的:川崎病(Kawasaki disease,KD)是一种常见的急性系统性血管炎性疾病,在亚洲儿童人群中发病率较高。若诊断延迟且未得到有效治疗,约有25%的患者可能发生冠状动脉病变,进而增加冠状动脉瘤(coronary artery aneurysms,CAA)的形成风险,严重时可诱发冠状动脉血栓、心肌梗死,甚至猝死。目前,静脉注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)是一种有效的治疗川崎病的方法,但约有高达30%的病例对IVIG显示耐药性。因此对川崎病的早期诊断和对IVIG治疗结果的预测非常重要。目前我国采用的以临床表现为诊断标准准确性较低,而且亦不能对IVIG的治疗结果进行预测,因此需要探索用于诊断和预测川崎病治疗效果的新型生物标志物。本研究的主要目的是筛选血清外泌体microRNA(miRNA)作为可用于川崎病的诊断及评估IVIG治疗的疗效潜在的生物标志物,从而提高川崎病的早期诊断的准确性及评估IVIG疗效。实验材料及方法:首先通过分析Gene Expression Omnibus数据库中登录号为GSE60965和GSE73577的微阵列数据来挖掘重要的外泌体miRNA,并分析其潜在机制。GSE60965为外泌体miRNA微阵列数据,分别包含5个健康儿童,5个川崎病患者和5个接受IVIG治疗的川崎病患者的三份合格血清样本;GSE73577为mRNA微阵列数据,来自包括IVIG治疗前后19位川崎病患者的外周血单核细胞样品。使用微阵列线性模型数据方法鉴定差异表达miRNA(DE?miRNA)和差异表达基因(DEG),并通过miRWalk 2.0数据库预测DE-miRNA的mRNA靶标。使用数据库注释,可视化和综合发现在线工具(DAVID)分析靶基因的功能,最终筛选得到一些重要的外泌体miRNA。通过干酪乳杆菌细胞壁提取物(LCWE)构建川崎病小鼠模型,进一步将川崎病小鼠模型分为模型组及IVIG治疗组。建模4周后,取小鼠血液及心脏组织,并进行苏木精-伊红(HE)染色。然后分离三组小鼠血清的外泌体,并通过粒径检测仪检测、电镜检测以及Western blot对外泌体进行鉴定。最后,我们采用Real-time PCR检测各组血清外泌体miRNA的表达情况。实验结果:在IVIG治疗后,在健康儿童与川崎病患者之间、川崎病患者与IVIG治疗后川崎病患者之间鉴定出65种具有不同表达模式的DE-miRNA。预测得到15种常见DE-miRNA的靶基因。在将DE-miRNA的靶基因与355个DEG重叠后,鉴定出28个共同基因,进一步筛选并构建了包含30个miRNA-mRNA调控关联的网络。在这些调控关系中,只有miR-328-spectrinα,erythrocytic 1,miR-575-环AMP响应元件-结合蛋白5/b-1,4-半乳糖基转移酶5/WD重复和FYVE结构域蛋白3/胱抑素A/CXC基序趋化因子受体1/蛋白质磷酸酶1调节亚基3B,miR-134-酰基-CoA合成酶长链家族成员1/C型凝集素结构域家族1成员A和miR-671-5p三联基序25/亮氨酸富含的重复激酶2/驱动蛋白家族成员1B/富含亮氨酸的重复神经元1参与基因表达的负调控。功能分析表明,鉴定出的靶基因可能与炎症有关。因此,血清外泌体miR-328,miR-575,miR-134和miR-671-5p可能通过影响炎症基因的表达,作为诊断川崎病和预测IVIG治疗结果的潜在生物标志物。接受LCWE注射后,模型组小鼠的外观及行为表现明显比对照组差,HE染色观察到在模型组冠状动脉局部出现明显的炎性细胞浸润,而对照组病理结果未见明显异常。将IVIG治疗组和模型组两组进行比较发现,接受IVIG干预后,IVIG治疗组小鼠的外观及行为表现均较模型组明显改善。心脏标本HE染色示IVIG治疗组中冠状动脉局部炎性细胞浸润的严重程度明显低于模型组。随后的电镜实验,外泌体粒径实验和Western blot实验结果均确认获得的颗粒是外泌体。以cel-miR-39作为RT-PCR外参发现,与对照组相比,模型组的mmu-miR-328-3p的表达水平极显著升高(p<0.01),mmu-miR-438-3p的表达水平显著升高(p<0.05),mmu-miR-671-5p的表达水平显著降低(p<0.05),但mmu-miR-134-5p的表达无明显变化。与模型组相比,经IVIG处理后,mmu-miR-328-3p(p<0.01),mmu-miR-438-3p(p<0.05)和mmu-miR-671-5p(p<0.01)均呈现相反的表达趋势,另外,mmu-miR-134-5p的表达有升高趋势,但是无统计学差异(p>0.05)。结论:miR-328和miR-671的表达水平与川崎病的病情发展及IVIG治疗改善程度密切相关,因此,这两种外泌体miRNA可作为诊断和评估IVIG治疗川崎病效果的潜在生物标志物。