脊髓损伤是由各种内部原因或者外部原因引起的脊髓的结构和/或功能的改变。外因主要有车祸、高空坠落或暴力性骨折等,这些原因可以造成脊髓的直接损伤,表现为损害平面以下出现运动障碍、感觉障碍、大小便等自主神经功能障碍,同时伴有病理性反射;内因主要有脊髓炎或脊髓肿瘤等原发性疾病压迫脊髓导致的损伤。根据前期研究结果证实,脊髓损伤后的病理生理学变化可以分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是由外因或内因直接作用于脊髓引起的不可挽回的机械损伤,可以引起脊髓的组织损伤或充血,病理生理学变化以神经元和神经胶质细胞的直接损伤为主,表现为神经细胞变性坏死、血和脊髓间的屏障破坏、细胞膜不完整、轴突膜断裂、髓鞘不完整或消失、微管系统被破坏、大量炎性物质释放和电解质紊乱。继发性损伤是指非直接原因引起的系列分子层面的损伤,使原发性损伤所造成的损伤严重恶化,主要表现为损伤后神经源性休克导致的血管调节障碍、系列生化反应引起的电解质改变、神经递质和氧化脂质堆积、水肿和细胞凋亡,其中起主要作用的是细胞凋亡。不同于其他组织,脊髓中的神经元为终末细胞,理论上不具有再生功能,当脊髓发生损伤后,损伤区域的细胞发生凋亡或变性坏死,神经元之间的突触连接破坏,传导功能丧失;在机体自我修复和应激的作用下,大量神经胶质细胞如星形胶质细胞等增生,这部分细胞在发挥神经元保护作用的同时在损伤区域大量积聚形成了胶质瘢痕,当再生的神经元触碰到胶质瘢痕时会停止生长,而且瘢痕还可以占据轴突伸展的空间,阻碍轴突连接的建立,导致损伤后神经元再生和传导功能恢复受限。现有的医疗救助和治疗可以使患者的生命得以延长,但是对于促进神经元的再生仍没有有效的治疗手段。近年来,部分学者开始关注继发性脊髓损伤引起的系列变化,他们认为限制继发损伤引起的凋亡进程和变性坏死,改善损伤局部微环境,减少各种有害因子的释放,为神经元轴突的再生创造良好的条件是提高脊髓损伤后治疗效果的一条有效途径。PI3K/AKT信号通路控制细胞增殖、应激和凋亡等多种细胞事件,目前被广泛应用于缺血再灌注损伤、炎症反应和肿瘤治疗研究中。内质网是神经元和非神经元细胞维持正常功能和存活的重要细胞器,有研究表明小鼠脊髓损伤后,内质网应激的特征性分子-成熟XBP1的mRNA表达水平明显上调,提示内质网应激可能参与了脊髓损伤的病理过程。本研究拟观察脊髓损伤后PI3K/Akt信号通路和内质网应激特异性蛋白的表达变化,分析PI3K/Akt信号通路和内质网应激在脊髓损伤中的作用,并通过加入PI3K、Akt特异性抑制剂的方法,探讨IPI3K/Akt信号通路和内质网应激在继发性脊髓损伤中发挥作用的可能机制,为临床上预防及减轻继发性脊髓损伤提供实验依据。具体研究内容如下:一、PI3K/Akt信号通路和内质网应激在脊髓损伤中的表达和作用[研究目的]观察PI3K/Akt和内质网应激信号转导通路关键因子在大鼠脊髓损伤后的表达量变化,分析两个通路是否参与脊髓损伤修复过程,并探讨其可能作用。[研究方法]制作大鼠脊髓损伤模型,采用组织病理学染色和BBB评分的方法判定模型制作效果;然后用免疫组织化学和免疫印迹的方法检测PI3K、Akt、p-Akt、GSK-3β、Bcl-2、caspase12、CHOP、Grp78、Eif-2α、p-Eif-2α、XBP1、Bad、p-Bad的分布密度和表达水平。分析各种因子在脊髓损伤后不同时间点的变化趋势。[研究结果](1)HE染色光镜下观察结果显示,正常组大鼠和假手术组大鼠脊髓组织的形态在手术后的不同时间点基本无变化,表现为脊髓组织质地均匀、灰质和白质结构之间界限清晰,放大后观察可见神经元数目较多、胞体较大、核仁明显,细胞未出现出血、水肿或者坏死的现象。脊髓损伤后1天、3天、7天组,显微镜下可见脊髓损伤区组织的形态结构不完整、有大小不等的空洞出现、神经组织有不同程度的缺损、灰质和白质之间的界限消失或不清楚,放大后观察可见损伤区域中心部位有大量泡沫细胞聚集,同时伴有炎性细胞浸润,灰质区域中的神经元细胞数量减少、形态不规则、核固缩、尼氏体减少、溶解进一步加重;白质区域中的上下行纤维减少、分布杂乱、形态结构不完整、髓鞘之间的间隙扩大且排列紊乱。与1天、3天、7天相比,脊髓损伤后14天、28天组,神经元的形态有一定程度的恢复、核仁可见、部分尼氏体恢复、但分布较不均匀。(2)BBB评分结果显示,正常组和假手术组大鼠活动自如、步态协调、行走平衡性好、抓地有力,BBB评分记为满分21分。脊髓损伤后1天组,大鼠仍然处于完全瘫痪状态,双后肢无任何运动能力,尾部耷拉朝下,无自主运动,BBB评分记为0分;损伤后3天组,大鼠出现轻微活动,但BBB评分达不到1分的标准;损伤后7天,大鼠双后肢的一或两个关节可以出现轻微的活动,BBB评分为1分;损伤后14天,大鼠双后肢的功能活动有部分恢复,一个关节可出现大幅度活动或者一个关节出现大幅度活动而另一个关节可以出现轻微活动,但是后肢不能负重,BBB评分为2分;损伤后28天,大鼠双后肢的两个关节可以出现大幅活动,但是后肢僵硬,BBB评分为3分。(3)免疫组织化学染色结果显示,显微镜下可在神经元的胞质中发现棕黄色、颗粒状的阳性染色区域,这些颗粒就是PI3K、Akt、CHOP、Grp78、Eif-2α XBP1、Bad等因子的阳性反应表现。正常组和假手术组大鼠脊髓组织中阳性反应颗粒较少,脊髓损伤后各组脊髓组织中阳性反应颗粒较多,经半定量统计发现,PI3K、Akt因子的表达量从损伤后1天开始逐步增加,到14天表达量最高,随后逐渐降低,但绝对表达量均比正常组高;CHOP、Grp78因子的表达量在损伤后1天最高,随后逐渐降低,但绝对表达量均比正常组高;XBP1、Bad因子的表达量从损伤后1天开始逐步增加,到3天表达量最高,然后逐渐降低,但绝对表达量均比正常组高;Eif-2α因子的表达量从损伤后1天开始逐步增加,到7天表达量最高,随后逐渐降低,但绝对表达量均比正常组高。(4)免疫印迹结果显示,PI3K、Akt、GSK-3β、caspase12、Bcl-2、Grp78、CHOP、Eif-2α、p-Eif-2α、XBP1、Bad、p-Bad等因子在脊髓损伤后表达显著增加,其绝对表达量均比正常组高(P<0.05);但是不同因子的表达高峰出现的时间不一致,PI3K因子的表达量从损伤后1天开始逐步增加,到3天表达量最高,随后逐渐降低;Akt、GSK-3β3、caspase12、Bcl-2因子的表达量从损伤后1天开始逐步增加,到7天表达量最高,随后逐渐降低;CHOP、XBP1、Eif-2α因子的表达量在损伤后1天最高,随后逐渐降低;Grp78、p-Eif-2α、Bad因子的表达量在从损伤后1天开始逐步增加,到7天表达量最高,随后逐渐降低;p-Bad因子的表达量在损伤后1天开始逐步增加,到3天表达量最高,随后逐渐降低。[结论]在大鼠脊髓损伤模型中,脊髓损伤后PI3K、Akt、p-Akt、GSK-3β等PI3K/Akt信号通路关键分子,凋亡相关因子Bcl-2、caspase12和内质网应激关键分子 CHOP、Grp78、Eif-2α、p-Eif-2α、XBP1、Bad、p-Bad 等的表达量出现逐步增高的趋势,达到高峰后,出现降低。这一结果与脊髓损伤后的“窗口期”变化一致,在这个时间内给予治疗效果最佳。二、PI3K/Akt信号通路和内质网应激在体外神经元损伤中的表达和作用[研究目的]观察PI3K/Akt和内质网应激信号转导通路关键因子在原代神经元损伤后的表达量变化,分析PI3K/Akt信号通路和内质网应激在体外划痕损伤神经元中的作用。[研究方法]大鼠神经元分离、原代培养,利用划痕的方法制作神经元损伤模型,采用流式细胞仪检测损伤后不同时间点细胞凋亡情况;然后用免疫细胞化学和免疫印迹的方法检测 PI3K、Akt、p-Akt、CHOP、Grp78、Eif-2α、p-Eif-2α、XBP1、Bad、p-Bad的表达水平。分析各种因子在脊髓损伤后不同时间点的变化趋势。[研究结果](1)AnnexinV-FITC/PI双染经流式检测结果显示,正常组的非凋亡细胞高达90.5%,凋亡细胞为4.2%;神经元损伤后4h,非凋亡细胞为75.1%,凋亡细胞为18.5%;神经元损伤后12h,非凋亡细胞降低为61%,凋亡细胞为34.4%;神经元损伤后24h,非凋亡细胞为66%,凋亡细胞为24.7%,提示神经元损伤模型的成功建立。同时,随着损伤后时间的不断推移,神经元损伤后凋亡率比例逐渐增高,12h凋亡比率最高,损伤24h后略有降低。(2)免疫细胞化学染色结果显示,原代培养神经元损伤后,内质网应激凋亡相关蛋白CHOP主要表达于胞核中,Grp78、XBP1、Eif-2α、Bad、p-Bad等因子主要表达于细胞的胞质中,均呈颗粒状,散在分布。(3)免疫印迹结果显示,PI3K、Akt和内质网应激诱导的凋亡蛋白 Grp78、CHOP、Eif-2α、p-Eif-2α、XBP1、Bad、p-Bad在正常神经元中几乎没有表达,在原代培养神经元划痕损伤后表达显著增加,其绝对表达量均高于正常神经元(P<0.05);但是不同因子的表达高峰出现的时间不一致,因子PI3K、Akt在损伤后24小时表达量最高,因子CHOP、XBP1在损伤后4小时表达量最高,因子Grp78在损伤后12、24、48小时的表达量持续较高,因子Eif-2α、p-Eif-2α、Bad、p-Bad在损伤后12小时表达量最高。[结论]在原代神经元损伤模型中,脊髓损伤后各种因子的变化趋势与在体实验一致,提示PI3K/Akt和内质网应激信号转导通路可能参与神经元损伤后的细胞凋亡过程。三、PI3K/Akt信号通路和内质网应激在脊髓损伤中的作用及机制[研究目的]观察加入PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂后通路关键因子在大鼠脊髓损伤后的变化规律,探讨PI3K/Akt信号通路和内质网应激在脊髓损伤中的作用机制,分析PI3K/Akt信号通路和内质网应激之间的交叉和关联。[研究方法]制作大鼠脊髓损伤模型,损伤后每天给予腹腔注射PI3K和Akt特异性抑制剂,用BBB评分的方法观察行为学变化,免疫印迹的方法检测PI3K、Akt、PI3K/Akt信号通路下游因子GSK-3β、p-GSK-3β和凋亡相关因子Bcl-2、bax、caspase 3、caspase 9、caspase12 的表达水平。[研究结果]BBB评分结果显示,加入抑制剂后,大鼠的评分有所提升,运动功能恢复效果好;Western Blot结果显示,加入抑制剂后,PI3K、Akt在脊髓损伤后不同时间点的表达量较未加抑制剂组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);加入抑制剂后,PI3K/Akt信号通路下游因子GSK-3β、p-GSK-3β和凋亡相关因子Bcl-2、bax、caspase 3、caspase 9、caspase12在脊髓损伤后不同时间点的表达量均呈现显著增强的趋势,其绝对表达量均高于正常组和假手术组(P<0.05)。[结论]加入PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂后,PI3K/Akt信号通路下游因子GSK-3β、p-GSK-3β和凋亡蛋白表达量增高。脊髓损伤后的病理生理变化是由多种因素共同参与的复杂过程,我们推测在这个过程中抑制凋亡的PI3K/Akt信号通路和促进凋亡的内质网应激之间存在关键因子的交叉和关联。我们可以在PI3K/Akt信号通路的下游因子中挑选与内质网应激相关的关键因子进行研究,以期为有效治疗继发性脊髓损伤提供新的靶点。