微藻油脂积累的环境调控及分子机制研究

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由于化石能源的枯竭及其所带来的环境污染问题,生物柴油的开发得到广泛关注,微藻由于光合效率高和油脂含量高等优点,被认为是生产生物柴油最具潜力的原料。此外,与传统的陆生油料植物相比,微藻还具有不占用耕地等优势。但由于生产成本较高,大规模使用微藻来生产生物柴油还没有实现。本文对10株藻种进行筛选,通过比较生物量、油脂含量和油脂产量,筛选出生长速度较快,油脂含量较高的Ankistrodesmus gracilis CJ09,对其进行全营养素分析,优化油脂提取方法,研究影响生长和油脂积累的培养条件,并进行转录组分析,进一步从分子水平分析油脂合成途径,为Ankistrodesmus gracilis CJ09基因改造提供参考依据。下面将研究主要成果概括如下:(1)选择10株藻种为研究对象,根据生物量、油脂含量和油脂产量指标,筛选出一株生长趋势较好,油脂含量较高的优势微藻,结果表明:Ankistrodesmus gracilis CJ09的生物量为1.92±0.06g/L,油脂含量为23.58±0.46%,油脂产量为0.45±0.007g/L,相对于其它微藻,最具有开发生物柴油的潜力。因此,选择Ankistrodesmus gracilis CJ09进行后续研究。(2)通过全营养素分析,Ankistrodesmus gracilis CJ09含有丰富的营养物质,总糖、蛋白质、油脂、水分、灰分和粗纤维的含量分别为7.02%、17.99%、23.68%、9.14%、10.92%和21.59%。A.gracilis CJ09中含有多种脂肪酸,其中C16、C18短链脂肪酸的相对含量为97.59%,C18:1(n-9)的相对含量为20.11%,可用来生产性能相对较高的生物柴油。A.gracilis CJ09中维生素VB1、VB3和VE的含量分别为17.84 mg/100g、14.26 mg/100g和9.22 mg/100g,其它维生素种类含量较低。A.gracilis CJ09的游离氨基酸种类丰富,包括人体8种必须氨基酸和两种鲜味氨基酸。A.gracilis CJ09中矿质元素种类丰富,其中钠、钾、钙、镁、锰、锌和铁的含量较高,分别为729.32 mg/kg、4539.20 mg/kg、6163.81 mg/kg、14384.02mg/kg、1265.55 mg/kg、641.48 mg/kg和8459.05 mg/kg,可作为动物体的矿物质元素来源。(3)为探索Ankistrodesmus gracilis CJ09油脂的利用价值,以油脂含量为指标,筛选出不同油脂提取方法中超声辅助法提取A.gracilis CJ09的油脂含量最高。对油脂提取条件进行响应面优化,所得的最佳提取条件为:提取功率521.12W,提取温度48.86℃,提取时间50 min,液料比30 m L/g,提取3次。6组实验表明:油脂提取率为26.07±0.78%。将超声辅助法提取的油脂甲酯化经GC-MS进行分析,发现使用超声辅助法提取的油脂中C16、C18短链脂肪酸可达98.56%,与藻粉直接甲酯化测得的脂肪酸含量相差不大,且超声提取法提取的油脂中C18:1(n-9)的相对含量为16.20%,略低于藻粉直接甲酯化脂肪酸。(4)对Ankistrodesmus gracilis CJ09培养条件进行优化,通过单因素实验考察硝酸钠浓度、磷酸二氢钾浓度、碳酸钠浓度、柠檬酸铁铵、二水合氯化钙和p H对A.gracilis CJ09生长和油脂积累的影响,结果表明:Ankistrodesmus gracilis CJ09的最适硝酸钠浓度为0.75g/L,最适磷酸二氢钾浓度为0.02g/L,最适碳酸钠浓度为0.08g/L,最适柠檬酸铁铵浓度为12mg/L,最适二水合氯化钙浓度为0.018g/L,最适初始p H为7.5。(5)对Ankistrodesmus gracilis CJ09进行转录组分析,共得到43M条raw reads,经过滤后,Q20值为94.31-96%,Q30值为83.84-86.8%,说明碱基被测错的概率低,转录组的分析结果更准确。使用Trinity对clean reads进行组装并聚类去冗余,得到66005条Unigene。使用七大功能数据库对Unigene进行注释,分别有53009个Unigene注释NR数据库(80.31%)、17915个Unigene注释到NT数据库(27.14%)、35198个Unigene注释到Swiss Prot(53.33%)、37607个Unigene注释到KOG数据库(56.98%)、42155个Unigene注释到KEGG数据库(63.87%)、45583个Unigene注释到GO数据库(69.06%)以及44712个Unigene注释到Pfam数据库(67.74%),将注释的Unigene进行GO、KOG和KEGG Pathway分类,并预测构建了油脂的合成途径、淀粉的合成途径和硫胺素的合成途径,为Ankistrodesmus gracilis CJ09油脂合成代谢的基因水平调控提供理论基础。
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