鼠痘病毒环介导等温扩增检测方法的研究

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环介导等温扩增法(LAMP)是一种新的核酸扩增法,在2000年初次出现。主要原理是对靶基因上人为设定的六个独立保守区,根据这六个区设计四种特异性引物:包括一对内引物(FIP和BIP)和一对外引物(F3和B3)。结合链置换DNA聚合酶在恒温条件(63℃左右)下保持30~60分钟。该方法在一定的温度下经过一步即可完成扩增,扩增效率极高,可在30~60分钟内实现109~1010倍的扩增。LAMP方法在实验结果观测上也具有显著优势。LAMP扩增反应结束会产生白色沉淀,而在反应中加入钙黄绿素就能在反应结束看到颜色变化,有黄绿色荧光即代表反应发生了扩增,无需经过电泳鉴定。由于其扩增效率高、反应简单快速、高特异性和反应结果只需肉眼观察的特点,LAMP法现今已广泛应用于病毒、细菌等的定性定量检测和临床疾病的诊断。本实验基于LAMP方法的原理对鼠痘病毒和仙台病毒进行检测并与传统PCR方对比,建立鼠痘病毒和仙台病毒的LAMP检测方法。根据鼠痘病毒保守基因设计多对LAMP引物,在实时浊度仪的跟踪监测下筛选出最佳引物进行实验。设定反应条件为63℃、反应时间为1小时,然后进行特异性实验和敏感性实验。结合PCR方法,对比两种实验方法的敏感性优劣。结果显示引物筛选实验选出一对基于Crmd基因设计的引物。而在特异性实验中证明其具有良好的特异性,应用这对引物与小鼠其他病毒反应,在设定时间内均不发生扩增。而鼠痘病毒反应迅速,在30分钟左右即开始发生扩增,并在5分钟之内达到了扩增高峰。在敏感性实验中,把鼠痘病毒DNA十倍稀释成100至10-6的7个稀释度,最后结果显示其最小检出度为5.3x10-4ng/μL。敏感度比PCR高。为了简化实验结果观测方法,在鼠痘LAMP检测反应中加入钙黄绿素荧光指示剂,对比阴性对照,结果显示发生扩增的反应出现了黄绿色荧光,肉眼明显可见。进一步经过琼脂糖凝胶电泳鉴定后出现连续性的条带。在标准法LAMP实验的基础上,为了达到进一步加快反应速率的效果,在原始LAMP引物的基础上设计了环引物。LAMP环引物是指在哑铃状结构5’末端环状单链区段(B1到B2区段、F1到F2区段)加入具有与之互补序列的环状引物Loop Primer F (LF)、Loop Primer B (LB), LF和LB使DNA合成起点变多,因此扩增反应进一步加速。本实验中鼠痘病毒环引物只设计了一条LB,但在实验中依然使反应速率有一定的提高。而在动物的回归实验中,选用BALB/c(?)、鼠和BALB/c裸鼠,病毒液浓度做10倍稀释后分为6组进行腹腔注射。采取小鼠血清和各器官组织,用血清做间接ELISA检测,提取DNA作为LAMP实验的样本进行实验。结果显示LAMP所有样本均能发生扩增,间接ELISA检测抗体实验BALB/c小鼠组阳性,而裸鼠组阴性。面对间接ELISA检测抗体可能出现的假阳性现象,LAMP有着更方便直观的优势。
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