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背景：癌干细胞(cancer stem cell, CSC)是肿瘤组织中存在数量稀少的癌细胞,具有自我更新、增殖和分化的潜能,在肿瘤形成、生长、复发和转移中起着决定性的作用,而且具备有以下基本特性：①自我更新,②高致瘤性,③耐药特性,④癌转移的“种子”细胞等,此外还有分化特性等诸多干细胞相关特性。目前研究认为CSC上述特性与癌症发生、发展、转移、耐药、放化疗抵抗、休眠和复发等恶性行为密切相关,被认为是抗癌药物靶向攻击的主要细胞。但癌干细胞在癌组织所占数量极少,寻找出有效的富集纯化癌干细胞的方法,是癌干细胞研究的首要步骤,可为寻找癌干细胞标志与进行后续的癌干细胞实验提供前期实验基础。对于舌癌而言,其癌干细胞的研究较少,而且认为CD44TCD24细胞即为舌癌干细胞标志,但本课题小组的前期研究发现,在舌癌细胞系TCA-8113中,CD44+阳性表达的癌细胞比例非常高,与癌干细胞占肿瘤的极低比例不相符,需要增加更多的细胞表面标志来明确舌癌干细胞,而在研究其细胞标志的基础工作中,建立富集舌癌干细胞模式则是舌癌干细胞标志前期实验研究的重要基础条件。目的：以癌干细胞的耐药特性为建立富集舌癌干细胞的切入点,配合机体环境或干细胞培养微环境,进行构建体内或体外的舌癌干细胞富集模式的实验研究。以此明确增高舌癌干细胞比例的富集模式,期望解决癌干细胞数量少而导致舌癌干细胞实验研究的“瓶颈”问题。明确细胞粘附因子受体4(CXCR4)作为舌癌干细胞候选标志的角色。方法：选取舌癌TCA-8113细胞系为研究对象,以化疗药物干预为基本手段,采用体外与体内两种微环境,建立富集舌癌干细胞模式,主要构建模式如下：(1)体外舌癌干细胞富集模式：①长期化疗药物干预模式：即是采用逐步递增化疗药物阿霉素浓度间歇作用的方法诱导舌癌细胞耐药,相当于诱导培养耐药舌癌细胞系,时间为8个月,命名为：TCA-8113/ADM-L;②体外短期施加化疗药物干预模式：0.02μg/ml阿霉素干预舌癌细胞,时长4天,命名为TCA-8113/ADM-S;在长期与短期化疗药物干预后,均加入干细胞培养基培养环境中。(2)在体舌癌干细胞富集模式：建立舌癌裸鼠皮下移植瘤动物模型,采用阿霉素(8mg／kg)每周一次尾静脉注射,与环磷酰胺(100mg/kg)腹腔注射,每8天为一个周期,连续注射3天,停药5天,待肿瘤直径为1.5cm时取材原代培养,并在体连续传代3～4次。舌癌干细胞富集模式的富集效率检测指标：①单克隆形成实验；②平板克隆形成实验：③“球囊”培养情况,即干细胞培养基中球囊形成情况；④CXVCR4流式细胞术检测。结果：TCA-8113细胞体外克隆增殖能力强,单细胞克隆形成率、平板克隆形成率分别是(77.71±3.74)%和(258.67±54.04)‰,TCA-8113阿霉素短期干预细胞TCA-8113／ADM-S单细胞克隆形成率、平板克隆形成率分别是(4.55±0.25)%和(32.00±9.00)‰,体外化疗药物低浓度阿霉素持续增量法可诱导形成耐药舌癌细胞系TCA-8113／ADM-L,耐药倍数达22倍,耐药细胞能将ADM排出细胞外,但单细胞克隆形成率、平板克隆形成率比亲本细胞降低,分别是(1.30±0.74)%和(20.00±5.29)‰。TCA-8113细胞、TCA-8113／ADM-S细胞、TCA-8113／ADM-L细胞在RPMI-1640培养基下CXCR4的表达率分别是：(32.31±18.69)%,(33.34±8.71)%,(7.15±2.14)%,在干细胞培养基下CXCR4的表达率分别是：(32.74±14.43)％,(29.90±5.26)％,(17.77±8.51)％。TCA-8113细胞、TCA-8113/ADM-S细胞、TCA-8113/ADM-L细胞在低粘附孔板上用干细胞培养基培养时均不能形成球囊。将舌癌细胞种植于裸鼠,形成异种移植瘤体内连续传代并给予一定剂量化疗药物(阿霉素、环磷酰胺)干预所得富集后细胞TCA-8113/ADM P1-、 TCA-8113/ADM P2细胞单细胞克隆形成率分别是：(20.10±4.1)％,(19.18±2.03)％,TCA-8113/ADM P1-、TCA-8113/ADM P2细胞平板克隆形成率分别是：(166.00±45.99)‰,(111.67±8.50)‰。TCA-8113/CTX P1-、 TCA-8113/CTX P2-、TCA-8113/CTX P3+、TCA-8113/CTX P4细胞的单细胞克隆形成率分别是：(24.67±10.60)％,(48.55±19.16)％,(31.67±6.03)％,(68.93±17.09)％,TCA-8113/CTX P1+、TCA-8113/CTX P2-、 TCA-8113/CTX P3+、TCA-8113/CTX P4细胞的平板克隆形成率分别是：(192.75±48.03)‰,(398.25±15.92)‰,(361.00±59.11)‰,(444.00±14.76)‰。 TCA-8113/ADM P1-、TCA-8113/ADM P2细胞CXCR4的表达率分别是：(35.37±40.90)％,(37.92±30.83)％,TCA-8113/CTX P1-、 TCA-8113/CTX P2+、TCA-8113/CTX P3+、TCA-8113/CTX P4细胞的CXCR4的表达率分别是：(37.40±37.16)％,(36.96±11.29)％,(43.00±21.13)％(37.92±30.83)％,TCA-8113/CTX P4细胞低粘附孔板上用干细胞培养基培养时能形成球囊,球囊形成率为：(8.25±3.41)%。结论：裸鼠皮下移植瘤传代联合环磷酰胺干预模式,可有效富集舌癌细胞系TCA-8113细胞中癌干细胞特性细胞群,单一的CXCR4并不适宜作为新的舌癌干细胞表而阳性标志。