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丁酸是一种广泛应用于化工、食品和医药等行业的短链有机羧酸,目前主要通过化学法合成,但供给远不能满足市场需求。随着石化资源的日益枯竭、传统能源消耗对环境污染的日渐加重以及大众对生物基化学品的偏爱,以微生物发酵法代替化学合成法生产丁酸已经成为必然的发展趋势。然而,微生物发酵产丁酸的工业化应用目前受到多方面因素的阻碍,如生产菌株对丁酸耐受性有限导致丁酸终浓度、得率和生产速率较低,副产物乙酸的存在增加了丁酸的分离纯化成本,廉价发酵基质利用存在问题造成丁酸发酵成本较高。针对微生物发酵产丁酸工业化应用面临的诸多问题,本课题拟通过代谢工程改造酪丁酸梭菌从而提高其丁酸产量、丁酸/乙酸比例以及对木质纤维素水解液的利用能力。在酪丁酸梭菌(Clostrdium tyrobutyricum)ATCC 25755中过表达6-磷酸果糖激酶基因(pfkA)和丙酮酸激酶基因(pykA)可以显著提高其胞内NADH和ATP水平,更高的胞内NADH和ATP水平赋予C.tyrobutyricum更高的丁酸产量和丁酸耐受性。在补料分批发酵模式下,重组菌株ATCC 25755/pfkA+pykA的丁酸产量和生产速率分别达到了48.19 g/L和0.50 g/L·h,与C.tyrobutyricum ATCC 25755原始菌株(以下简称为原始菌株)相比分别提高了38.00%和38.89%。此外,ATCC 25755/pfkA+pykA还具有更高的葡萄糖耐受性,在120 g/L葡萄糖浓度下进行发酵其丁酸生产速率达到0.82 g/L·h。进一步研究丁酸和乙酸代谢合成耦联机制,发现强化乙酰辅酶A到丁酸合成的代谢流(过表达丁酰CoA∶乙酸CoA转移酶基因cat1和巴豆酸酶基因crt)可以显著降低C.tyrobutyricum的乙酸产量。重组菌株ATCC 25755/cat1+crt的丁酸/乙酸比例达到15.75g/g,与原始菌株相比提高了124.04%,但其丁酸产量无明显提高。为同时提高丁酸产量及丁酸/乙酸比例,本研究尝试在C.tyrobutyricum中同时过表达pfkA、pykA、cat1和crt,重组菌株命名为ATCC 25755/ppcc。补料分批发酵结果证实重组菌较好地综合了ATCC25755/pfkA+pykA和ATCC 25755/cat1+crt的优势,其丁酸产量和丁酸/乙酸比例分别达到了47.63 g/L和13.72 g/g,与原始菌株相比分别提高了36.44%和95.16%。研究初步探索了Class I型热激蛋白在C.tyrobutyricum抵御丁酸胁迫过程中的作用。荧光定量PCR检测表明,丁酸胁迫下Class I型热激蛋白基因(grpE、dnaK、dnaJ、groES、groEL和htpG)的表达量均大幅上调,揭示其在C.tyrobutyricum应对丁酸胁迫的过程中起着重要作用。随即,通过丁酸耐受性测试和补料分批发酵检测在C.tyrobutyricum中过表达Class I型热激蛋白基因对其丁酸耐受性和丁酸产量的影响,结果表明ATCC25755/groESL的丁酸产量和丁酸耐受性显著提高,其丁酸产量和丁酸抑制常数分别达到了44.13 g/L和3.52 g/L,与原始菌株相比分别提高了28.21%和101.14%。针对木质纤维素水解液中毒性抑制物会严重抑制细胞生长和丁酸合成的问题,成功通过过表达groESL强化C.tyrobutyricum对木质纤维素水解液的耐受性。摇瓶发酵测试表明以大豆皮水解液(Soybean hull hydrolysate,SHH)、玉米芯水解液(Corn cob hydrolysate,CCH)和大豆秸秆水解液(Soybean straw hydrolysate,SSH)为底物进行发酵时,C.tyrobutyricum原始菌株的丁酸产量可以分别达到17.62 g/L、17.22 g/L和16.71g/L;而以水稻秸秆水解液(Rice straw hydrolysate,RSH)、玉米秸秆水解液(Corn straw hydrolysate,CSH)和小麦秸秆水解液(Wheat straw hydrolysate,WSH)为底物发酵时,原始菌株的丁酸产量分别只有14.23 g/L、12.84 g/L和11.22 g/L,表明RSH、CSH和WSH对C.tyrobutyricum毒性较高。以RSH、CSH和WSH为底物发酵时,ATCC25755/groESL的丁酸产量与原始菌株相比分别提高了18.90%、25.62%和18.89%,表明ATCC 25755/groESL对木质纤维素水解液具有较高的耐受性。水解衍生抑制物毒性测试证实过表达groESL可以显著增强C.tyrobutyricum对酚类、呋喃类和稀酸类衍生物的耐受性,尤其是对酚类物质具有更强的耐受性。以CSH和RSH为底物在补料分批发酵模式下进行发酵,ATCC 25755/groESL的丁酸产量分别达到29.62 g/L和30.12 g/L,与原始菌株相比分别提高了19.57%和26.53%;同时由于其延滞期明显缩短,丁酸生产速率分别提高了47.62%和55.00%。此外,在C.tyrobutyricum中表达来自于C.beijerinckii NCIMB 8052的短链脱氢酶/还原酶(short-chain dehydrogenase/reductase,SDR)基因可以显著增强其对糠醛的耐受性。糠醛耐受性测试表明原始菌株对糠醛的耐受性低于2.5 g/L,而重组菌株ATCC25755/sdr对糠醛的耐受性达则到了3.0 g/L以上,这是因为重组菌株能更快地将进入胞内的糠醛还原为低毒性糠醇;并且随后的酶活性测试也证实以NADPH为还原力时,ATCC 25755/sdr的胞内糠醛还原相关酶活性与原始菌株相比提高了4倍左右。摇瓶发酵测试表明以玉米芯稀酸水解液为底物发酵时,ATCC 25755/sdr的丁酸产量和生产速率分别达到了20.84 g/L和0.15 g/L·h,与原始菌株相比分别提高了10.15%和36.36%。本课题致力于采用代谢工程手段强化C.tyrobutyricum的丁酸发酵性能,在提高C.tyrobutyricum丁酸产量和选择性、丁酸耐受性以及对木制纤维素水解液利用能力方面做了较为系统的研究,为微生物发酵法产丁酸的发展提供了新思路。