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抗体药物已成为当今生物技术药物的支柱产业,截至2006年,FDA已批准26个体内用抗体药物,其中治疗剂21个。抗体药物在全球的年销售额从1997年的3.10亿美元上升到2005年的150亿美元;其在生物制药产业中所占份额也从2000年的1/5上升到2005年的1/3。目前,抗体药物已进入基因工程抗体时代,在全球已报道的10万多种抗体中,基因工程抗体有1000多种。基因工程抗体的快速发展,对于人类重大疾病的诊断、预防与治疗提供了新方法、新途径。但是阻碍基因工程抗体产业化发展的瓶颈是其表达和纯化。目前用于制备基因工程抗体的表达系统主要有原核表达系统(包括分泌表达系统和包涵体表达复性系统)和真核表达系统。其中毕赤酵母表达系统不但具有许多真核表达系统的优点(如翻译后修饰等),而且比其他真核表达系统具有操作简便成本低廉的优点,因此广泛应用于基因工程抗体的表达。本文以毕赤酵母表达的抗人角蛋白Fab抗体片段为目标产品,旨在建立毕赤酵母表达基因工程抗体高效发酵及纯化工艺。相应研究分为三部分:1).酵母表达条件优化。在摇瓶中,采用正交试验研究甘油添加量、温度、pH三因素三水平对培养阶段酵母生长的影响;研究诱导时机、甲醇添加量、温度、pH四因素四水平对诱导表达阶段蛋白表达的影响。在摇瓶阶段取得较高的细胞密度和蛋白表达量。2).分批-补料发酵工艺优化。在5L发酵罐规模,分别研究不同甘油补加速率对培养阶段酵母生长的影响;研究不同甲醇补加速率对诱导表达阶段蛋白表达的影响;研究不同硫酸铵补加浓度对酵母生长和蛋白表达的影响。通过5L发酵罐放大培养获取较高的细胞密度和蛋白表达量。3).建立和优化分离纯化工艺。采用生物信息学预测蛋白性质,利用蛋白之间的性质差别,选择合适的层析方法,优化层析过程参数,获取高纯度、高回收率、生物功能良好的基因工程抗体。本课题确定了以下发酵和纯化工艺:1).酵母表达条件:确定1%甘油添加量,29℃,pH6.5为最佳的培养条件,培养结束后4小时开始诱导表达,以1%甲醇添加量,29℃,pH6.25为最佳的诱导表达条件,在摇瓶中细胞密度达OD600=15.3,活性95%,抗体表达量达9mg/L,为发酵罐放大培养奠定了基础。2).分批-补料工艺:确定溶解氧含量(dissolved oxygen, DO)的拐点上升作为最佳的补料时机。以9ml/(L/h)流速补加甘油同时补加硫酸铵至终浓度0.5g/L;以6ml/(L/h)流速补加甲醇同时补加硫酸铵至终浓度1g/L蛋白表达量可以达到较高的,发酵结束时OD600≥250,活性90%,Fab表达量达150mg/L。与摇瓶相比细胞密度提高17倍,Fab表达量提高16倍。3).分离纯化工艺:首先,根据本中心实际以及生物信息学分析确定的蛋白质间疏水性差别确立疏水层析分离。在四种疏水介质中选择疏水性差别最大的介质PPG-600M。其次,确定纯化分离参数:平衡缓冲液为20mM PB+1M(NH4)2SO4,pH7.2;洗脱缓冲液为20mM PB+1M(NH4)2SO4,pH7.2;洗脱方法为30%(2CVs)洗脱液梯度洗脱-60%(2CVs)洗脱液梯度洗脱-100%(2CVs)洗脱液梯度洗脱;再生溶液为6M尿素;柱床高度12.5cm;平衡和再生流速为10ml/min,洗脱流速为5ml/min。经上述分离纯化工艺获得的抗人角蛋白Fab抗体片段纯度≥90%、回收率≥85%,生物功能良好。同时在5L规模证明该工艺具有进一步放大的潜能。根据以上结果,我们确定了毕赤酵母表达抗人角蛋白Fab抗体片段的最佳培养与诱导表达条件,确定了甘油、甲醇、硫酸铵的补加策略,优化了酵母分批-补料发酵工艺。5L罐发酵结束后,细胞密度和蛋白表达量较摇瓶阶段提高17倍和16倍。成功分离纯化抗人角蛋白Fab抗体片段,解决了该基因工程抗体药物研发的关键问题。初步建立了毕赤酵母表达基因工程抗体高效发酵及纯化工艺。