【摘 要】
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数字核酸等温扩增技术作为近年来的一种新型分子定量检测方法,具有传统PCR扩增所不具备的优点。例如没有连续变温的精确温度控制要求,以及无需依赖标准曲线和内参基因即可实现样本中微量或痕量分子的绝对定量检测等优点。因此得以在微生物快速检测领域得到广泛的应用。本文基于本课题组研制的万级高密度数字PCR微流控芯片以及等温扩增技术,着重研究了荧光检测以及图像处理等关键技术,并在此基础上研发了一款配套的等温扩增检测分析系统装置。最后通过所设计的数字核酸等温扩增实验对系统进行测试评估。本文的主要工作包括:
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数字核酸等温扩增技术作为近年来的一种新型分子定量检测方法,具有传统PCR扩增所不具备的优点。例如没有连续变温的精确温度控制要求,以及无需依赖标准曲线和内参基因即可实现样本中微量或痕量分子的绝对定量检测等优点。因此得以在微生物快速检测领域得到广泛的应用。本文基于本课题组研制的万级高密度数字PCR微流控芯片以及等温扩增技术,着重研究了荧光检测以及图像处理等关键技术,并在此基础上研发了一款配套的等温扩增检测分析系统装置。最后通过所设计的数字核酸等温扩增实验对系统进行测试评估。本文的主要工作包括:
1)研究设计了等温扩增检测分析系统装置结构,其中包括:高均匀度荧光图像采集模块的设计;高精度升降温模块的设计,以及实现芯片位置调整的高精度三维载物平台模块的设计。
2)基于WinAPI与C++结合的MFC类库开发了具备下位机子模块的通讯控制(包括对温度、载物平台的控制)、科研级数字显微相机参数设置、荧光图像采集与处理、阳性分子数统计、以及对实验数据计算分析的结果进行数据库管理等功能的windows应用软件,实现了良好的人机交互性能。
3)针对本课题组自主研发的万级高密度自吸式数字PCR微流控生物芯片采集到的荧光图像特点,采用了改进的ORB算法的图像拼接方法、优化的霍夫检测算法的图像倾斜校正方法;以及设计提出的全局与局部阈值分割相结合的荧光亮点分割方法,实现对阳性分子数的精确计数,得出准确可靠的实验结果。
4)在开发的等温扩增检测分析系统装置中完成生物微流控芯片中的数字PCR扩增实验,对采集到的荧光图像进行分析和处理,进而对系统进行测试评估。
本文系统装置的成功研制,意味着将数字化微流控生物芯片等温扩增实验、荧光信号采集,以及数据处理功能集成一体的系统解决方案的成功。促进了数字等温扩增RCR技术的发展和普及。
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