【摘 要】
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原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤,恶性程度高,预后很差,整个人群的肝癌5年生存率只有5%左右。近年来的研究表明原发性肝癌的发生是一个多基因参与的,通过不同基因、在不同时
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原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤,恶性程度高,预后很差,整个人群的肝癌5年生存率只有5%左右。近年来的研究表明原发性肝癌的发生是一个多基因参与的,通过不同基因、在不同时相的差异表达进行调控的复杂过程。由于目前发现的与肝癌发生发展密切相关的基因较少,通过寻找、克隆肝癌新的相关基因,弄清其结构、功能,从基因水平认识肝癌发生的分子机制,对肝癌的基因诊断和基因治疗具有重要意义。在先前的研究中,我们通过抑制消减杂交法(Suppression subtractive hybridization,SSH)对肝癌组织与癌旁肝组织之间差异表达的基因进行分离、鉴定,发现了1条新的基因cDNA片断(EST),并克隆出该基因的全长cDNA序列。它与近期登录的基因BC047440同源。RT-PCR分析显示BC047440基因在肝癌组织中的表达强度明显高于正常肝组织或癌旁组织。目的:构建肝细胞癌高表达新基因BC047440的反义真核表达载体,探讨BC047440基因在肝细胞癌发生发展中的作用。方法:1.提取人原发性肝细胞癌组织总RNA,经逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增BC047440基因的cDNA片断,与pMD18-T simple载体连接,筛选、扩增、抽提质粒和双酶切后,将纯化的BC047440基因的cDNA片断反向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒中,然后筛选、扩增、抽提质粒,从而构建BC047440基因的反义真核表达载体pcDNA3.1(+)BC047440AS,最后测序鉴定。2.通过DOTAPTM脂质体介导的转染技术,将BC047440基因的反义真核表达载体导入肝癌细胞HepG2,经G418筛选,获得稳定表达BC047440反义基因的肝癌细胞HepG2-BC047440AS。设计转染pcDNA3.1(+)质粒的肝癌细胞HepG2-pcDNA3.1(+)及未转染的肝癌细胞HepG2作为对照组,采用半定量RT-PCR检测反义BC047440基
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