论文部分内容阅读
高血压是最常见的复杂疾病之一，据估计到2025年全球近三分之一人口将患高血压。高血压分为原发性高血压和继发性高血压，其中患病人群中有95%为原发性高血压。原发性高血压由生理、遗传、环境和饮食等多种因素相互作用，病因复杂。有报道发现，高血压患者比健康人群携带更高比率的线粒体tRNA突变，突变会对tRNA前体的加工、核苷酸修饰和氨酰化等过程产生影响，因此推测线粒体tRNA突变与原发性高血压的发生存在一定的相关性。本研究发现了1例携带线粒体tRNATrp5512A＞G突变(以下简称m.5512A＞G突变)的家系，对家系成员进行临床资料调查和分子遗传学分析，通过转线粒体融合细胞实验构建细胞株后应用分子生物学和细胞生物学实验探究m.5512A＞G突变和原发性高血压的相关性。
目的：通过转线粒体融合细胞实验构建携带m.5512A＞G突变和正常无突变的细胞株，通过RNA、DNA及蛋白等层面初步探讨m.5512A＞G突变在原发性高血压中的内在致病机理。
方法：本研究先采用线粒体全基因组测序的方法对课题组长期收集的原发性高血压样本进行系统地筛查，发现了1例携带m.5512A＞G突变家系，其可能具有母性遗传的特征。收集家系成员的临床和遗传资料，对tRNATrp二级结构、保守性进行分析，运用聚乙二醇（PEG）诱导法将课题组前期收集的永生化淋巴细胞与线粒体DNA（mtDNA）缺失的ρ0206细胞融合，构建了具有相同核背景和单体型且携带m.5512A＞G突变（突变组）与正常无突变（对照组）的转线粒体融合细胞模型。从两组构建成功的转线粒体融合细胞中各挑选出拷贝数相近的三株细胞进行线粒体相关功能研究，包括tRNATrp构象改变、tRNATrp稳态水平检测、tRNATrp氨酰化、相关分子表达、线粒体ATP检测、细胞内活性氧（ROS）检测及线粒体膜电位变化。
结果：根据先证者及其家系成员的线粒体基因全序分析结果，家系成员均携带m.5512A＞G突变且对应单体型为A。病史询问及血常规、生化指标等检查结果显示，家系成员均排除继发性高血压可能。线粒体tRNATrp5512位点位于tRNATrp5′端，该位点在17种灵长类物种中保守性指数为100%。成功构建的对照组与突变组的转线粒体融合细胞系均生长良好，挑选出两组拷贝数相近的细胞株进行的一系列生化、分子和细胞功能研究结果如下：在非变性环境中，突变组tRNATrp分子电泳迁移速率慢于对照组；Northern blot实验结果显示，突变组tRNATrp稳态水平相比对照组下降39.1%（P=0.018），且突变细胞株平均氨酰化水平下降约29.6%（P=0.025）；对线粒体氧化磷酸化亚基的CO2、CO1、CO3、ND5蛋白表达量进行检测，其中对应CO2蛋白的表达量水平平均下降约85.5%（P＜0.001），而CO1、CO3、ND5蛋白表达量与对照组无统计学差异（P＞0.05）；突变组细胞株ATP水平下降约13.3%（P=0.155）无统计学差异、线粒体ATP水平下降约51.2%（P=0.038）；突变组细胞株细胞活性氧含量平均增加约50.6%（P=0.01）、氧胁迫下条件下细胞活性氧产量平均增加约61%（P＜0.001）；突变组细胞平均线粒体膜电位水平下降约46.5%（P=0.04）。
结论：m.5512A＞G突变会影响tRNATrp构象、稳态水平和氨基酰化，异常的tRNATrp代谢会导致线粒体tRNA编码的多肽减少、线粒体ATP合成减少及细胞氧化呼吸链损伤，包括ROS增加和线粒体膜电位水平降低。
目的：通过转线粒体融合细胞实验构建携带m.5512A＞G突变和正常无突变的细胞株，通过RNA、DNA及蛋白等层面初步探讨m.5512A＞G突变在原发性高血压中的内在致病机理。
方法：本研究先采用线粒体全基因组测序的方法对课题组长期收集的原发性高血压样本进行系统地筛查，发现了1例携带m.5512A＞G突变家系，其可能具有母性遗传的特征。收集家系成员的临床和遗传资料，对tRNATrp二级结构、保守性进行分析，运用聚乙二醇（PEG）诱导法将课题组前期收集的永生化淋巴细胞与线粒体DNA（mtDNA）缺失的ρ0206细胞融合，构建了具有相同核背景和单体型且携带m.5512A＞G突变（突变组）与正常无突变（对照组）的转线粒体融合细胞模型。从两组构建成功的转线粒体融合细胞中各挑选出拷贝数相近的三株细胞进行线粒体相关功能研究，包括tRNATrp构象改变、tRNATrp稳态水平检测、tRNATrp氨酰化、相关分子表达、线粒体ATP检测、细胞内活性氧（ROS）检测及线粒体膜电位变化。
结果：根据先证者及其家系成员的线粒体基因全序分析结果，家系成员均携带m.5512A＞G突变且对应单体型为A。病史询问及血常规、生化指标等检查结果显示，家系成员均排除继发性高血压可能。线粒体tRNATrp5512位点位于tRNATrp5′端，该位点在17种灵长类物种中保守性指数为100%。成功构建的对照组与突变组的转线粒体融合细胞系均生长良好，挑选出两组拷贝数相近的细胞株进行的一系列生化、分子和细胞功能研究结果如下：在非变性环境中，突变组tRNATrp分子电泳迁移速率慢于对照组；Northern blot实验结果显示，突变组tRNATrp稳态水平相比对照组下降39.1%（P=0.018），且突变细胞株平均氨酰化水平下降约29.6%（P=0.025）；对线粒体氧化磷酸化亚基的CO2、CO1、CO3、ND5蛋白表达量进行检测，其中对应CO2蛋白的表达量水平平均下降约85.5%（P＜0.001），而CO1、CO3、ND5蛋白表达量与对照组无统计学差异（P＞0.05）；突变组细胞株ATP水平下降约13.3%（P=0.155）无统计学差异、线粒体ATP水平下降约51.2%（P=0.038）；突变组细胞株细胞活性氧含量平均增加约50.6%（P=0.01）、氧胁迫下条件下细胞活性氧产量平均增加约61%（P＜0.001）；突变组细胞平均线粒体膜电位水平下降约46.5%（P=0.04）。
结论：m.5512A＞G突变会影响tRNATrp构象、稳态水平和氨基酰化，异常的tRNATrp代谢会导致线粒体tRNA编码的多肽减少、线粒体ATP合成减少及细胞氧化呼吸链损伤，包括ROS增加和线粒体膜电位水平降低。