神经干细胞应用于移植治疗人类中枢神经系统退行性疾病及脊髓受损等疾病展示了光明的前景。同时,它也为药物测试提供了快速、简便、有效的筛选平台。但目前神经干细胞的来源非常有限,其数量远远不能满足人类研究和应用的需要,因此,体外大规模获得神经干细胞是一项亟待解决的课题,但当前关于这方面的研究却较少。因此,本文旨在研究神经干细胞体外悬浮培养的方法,通过对各个培养条件的研究,在保持神经干细胞特性的同时,达到能够使其在体外快速、高效的扩增目的。 本论文研究应用旋转壁式生物反应器(RWV)大规模培养神经干细胞。 首先从孕13-15天小鼠的胎鼠前脑部位分离获取神经干细胞,在体外悬浮培养,并通过显微观察、免疫荧光等方法对其进行干细胞特性检验。结果显示,所获取的神经细胞能在体外以聚集球形式悬浮生长,分离培养的细胞确为神经干细胞。从而保证了所研究对象的准确性,并为实验准备了数量充足的神经干细胞。 其次,对旋转壁式生物反应器内神经干细胞的大规模培养作了有关神经干细胞培养条件及旋转壁式生物反应器培养条件的预实验。以静态培养为基础,根据扩增倍数比较实验得出较适宜的接种密度—2×10~5cells/ml;通过观察分析及直径分布统计实验,得到细胞生长到5-6天(神经球尺寸在100μm)时是最佳的传代时间。同时,利用血气分析仪对旋转壁式生物反应器内的氧条件进行分析,对比静态孵箱中的氧培养条件,实验得到在直接充氧的氧供应方式及0.273ml/min的培养基灌注率下,旋转壁式生物反应器可为细胞生长提供适宜的氧环境。并且根据分析及实验得到RWV的适宜转速为7-10rpm。 最后,在预实验的基础上,将神经干细胞以2×10~5cells/ml的密度接种到确定好条件的旋转壁式生物反应器内进行悬浮培养。通过显微观察、cck-8试剂盒、免疫荧光、核型分析等方法分析细胞的生长状态、增殖能力和干细胞特性,并检测培养过程中营养物质的代谢情况。同时与静态T-Flask中的培养进行对比研究。结果表明,RWV中培养的神经干细胞能以聚集形式悬浮生长,生长的细胞状态良好,干细胞特性及遗传特性良好。与静态T-Flask中培养相比,RWV中培养的细胞扩增倍数大于静态培养的细胞,倍增时间远小于静态培养的细胞,说明RWV中培养的神经干细胞具有较好的扩增能力和较强的细胞活性。因此,旋转壁式生物反应器适于建立一种理想的神经干细胞体外培养的三维体系。