当今社会生活水平及医疗水平大幅度提高,世界老龄化速度加快,而我国已经提前进入老龄化社会,对抗衰老药物及抗衰老保健品的需求也越来越迫切。就目前而言,人类衰老机理比较成熟且具一定影响力的是端粒假说,其中心思想即,染色体末端端粒减少,寿命缩短,生物体衰老。那么激活细胞内存在的端粒酶,就可以延长端粒长度,促进细胞分裂,从而延长寿命,达到延年益寿的效果。近年来美国Geron等生物技术公司及营养保健品公司均已证实环黄芪醇(CAG)具有显著的端粒酶激活作用,而且是目前唯一一个可在人体细胞中激活端粒酶的原料,是一种具有开发前途的抗衰老物质。目前研究人员已对CAG的药效学和药动学开展了一定的研究工作。药效学实验表明,CAG具有较为显著的抗小鼠衰老活性,其作用机制与提高T-SOD、T-AOC活力,降低MDA含量,增加HYP含量有关;大鼠口服药代动力学显示三个给药剂量组(10,20和40 mg.kg-1)具有基本一致的达峰时间,各组Cmax和AUC0～t的增加与剂成正比,提示CAG在给药剂量区间以内是呈线性药代动力学特征;Caco-2单层细胞模拟肠吸收实验显示CAG主要以被动扩散的形式通过细胞,表明其在肠道可有效吸收;在大鼠及人肝微粒体体外代谢实验中,CAG可被广泛代谢。然而,有关CAG的口服生物利用度及其更详尽的体内过程尚不清楚;本实验将从CAG的静脉注射药代谢动力学入手,分析鉴定CAG大鼠体内代谢产物及其对大鼠肝脏药物代谢酶活性的影响,以期为CAG进一步开发利用提供实验依据。本论文主要包括以下四部分内容:文献综述主要对抗衰老药物的研究进展、黄芪甲苷及研究对象CAG的研究进展、生物样品的前处理过程及检测技术进行总结分析,以期把握抗衰老药物和CAG研究的前沿动态,并为实验的开展提供理论和技术支持。实验一包括两部分内容:(1)CAG大鼠单次静脉注射的药代动力学研究及其肝肠循环现象的验证;(2)CAG在大鼠体内经胆汁、尿液及粪便排泄及粪便中Ⅱ相代谢产物的验证。(1)CAG大鼠静脉注射药代动力学及肝肠循环现象的验证通过大鼠股静脉注射CAG注射液(10 mg.kg-1),于注射后2,5,10,15,20,30,50,80,1 110,170,230,290,350,410 min 颈动脉采血,样品处理后,HPLC-MS测定各个时间点的血药浓度,Winnolin.V.4.1药代动力学软件采用非房室模型计算主要药动学参数,并结合前期大鼠灌胃实验结果计算大鼠口服生物利用度;通过对胆汁中排泄的研究其是否具有肝肠循环现象。本次实验研究表明:CAG大鼠口服生物利用度为17.4%,远高于黄芪甲苷仅3%的生物利用度;肝肠循环验证实验发现CAG原型在大鼠体内确实存在肝肠循环现象,而且发现CAG在大鼠体内发生异构,其异构体也经过胆汁排泄。(2)胆汁、尿液及粪便排泄粪便中Ⅱ相代谢产物的鉴定本实验通过对大鼠静脉注射CAG(10 mg·kg-1)后12 h胆汁样品、灌胃CAG(20 mg·kg-1)后24 h尿液及粪便样品进行分析,确定其排泄途径及排泄形式。结果显示大鼠静脉注射CAG(10 mg·kg-1)后12h胆汁中原型排泄量为104.4 μg·kg-1,排泄率为1.044%,CAG异构体排泄量为68.63 μg.kg-1,排泄率为0.6863%;在大鼠灌胃CAG 24h尿液中未检测到CAG及其异构体;而在大鼠粪便中同样检测到CAG原型及其异构体,其中原型排泄量为2.118 mg.kg-1,排泄率为10.6%。推测CAG原型及其异构体主要排泄途径是粪便排泄,其余大部分C A G经体内代谢后以代谢物的形式排出体外。采用葡糖醛酸酶酶解实验、硫酸酯酶酶解实验,对CAG灌胃大鼠粪便中葡糖醛酸结合产物与硫酸结合产物进行定性鉴别,以SPSS17.0软件进行数据分析,葡糖醛酸酶酶解实验、硫酸酯酶酶解实验与对照组均无显著性差异,推测CAG并未以葡糖醛酸结合物与硫酸结合物的形式经粪便排泄,或存在量极低。实验二连续灌胃CAG对大鼠P450酶的抑制作用及其抑制类型分析。大鼠连续7 d灌胃CAG溶液(40 mg·kg-1·d1)诱导肝药酶后,采用Cocktail探针底物与大鼠肝微粒体体外温孵法,通过HPLC同时测定5种探针药物美托洛尔、氨苯砜、非那西丁、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲的代谢消除率,评价CAG 对 CYP2D6、CYP3A4、CPY2A1、CPY2E1 和 CPY2C9 亚酶活性的影响。结果显示连续灌胃CAG对大鼠肝微粒体CPY2E1亚酶活性具有显著诱导作用,对CYP3A4亚酶活性具有显著抑制作用,而对CYP2D6、CPY2A1、和CPY2C9亚酶活性无显著影响;采用体外大鼠肝微粒体温孵法进一步研究其对CYP3A4亚酶的抑制类型,结果显示,CAG对CYP3A4亚酶的抑制类型为竞争性抑制。RT-PCR实验结果表明,大鼠连续7天灌胃CAG对其肝脏的CYP1A1、CYP2B1、CYP2C11、CYP2E1、CYP3A1 基因表达均有诱导趋势。其中Cocktail法评价大鼠连续7天灌胃CAG对其肝脏的CYP450活性影响的研究中,发现大鼠连续7天灌胃CAG对CYP2E1有诱导作用,与本实验实验结果一致;对其余4种CYP450亚酶活性的影响趋势有待进一步的验证。全文总结与讨论本实验研究结果表明,CAG大鼠口服生物利用度为17.4%,显著高于其皂苷黄芪甲苷3%,具有更广阔的开发应用前景。在其排泄及Ⅱ相代谢的实验研究中,发现CAG在大鼠体内存在肝肠循环现象,并且CAG在体内发生异构,其异构体亦经过胆汁排泄;大鼠灌胃CAG的实验研究表明,CAG未经大鼠尿液排泄或排泄量极低,而原型经粪便排泄率为10.6%,推测有极大部分CAG以代谢物的形式排出体外。连续灌胃CAG对大鼠肝微粒体对CYP2D6、CPY2A1、和CPY2C9亚酶活性无显著影响,对CPY2E1亚酶活性具有显著诱导作用,对CYP3A4亚酶活性具有显著抑制作用,且其抑制类型为竞争性抑制;而大鼠连续7天灌胃CAG对其肝脏的 CYP1A1、CYP2B1、CYP2C11、CYP2E1、CYP3A1 基因表达均有诱导趋势。本实验研究旨在研究CAG的体内过程,为CAG的剂型设计提供实验依据,较黄芪甲苷其生物利用度更高,有望开发为新一代的抗衰老药物;通过研究分析连续灌胃CAG对大鼠CYP450酶的抑制作用及其抑制类型,进一步研究其对基因表达的影响;为其将来的临床应用提供实验依据,尽量减少药物代谢性相互作用的发生。