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犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)属细小病毒科细小病毒属,是引起犬出血性肠炎和幼犬心肌炎的主要病原。CPV-2 只感染犬,具有高度的接触性传染性,各种年龄的犬都能感染,断奶后的幼龄犬(尤其12 周龄以下的)最易感此病,发病率和病死率分别为20%-100%和10%-50%,临床表现为剧烈的呕吐、腹泻和排出恶臭的粪便。快速准确的诊断是有效预防本病的前提条件。病毒的VP2 蛋白既是CPV 的主要免疫保护性抗原,又是良好的诊断抗原,因此,该基因的克隆及表达,对于制备新型疫苗和特异性诊断抗原具有重要意义。本研究利用猫肾细胞(F81)繁殖了并扩增了分离得到的HL-1 株VP2 基因。根据Genbank已发表的CPV-2 VP2 基因的序列,利用primer 5.0 软件设计并合成一对引物,通过PCR 扩增出长约1.8kb 的基因片段,命名为VP2。将其克隆至pMD-18-T 载体,构建了重组质粒pMD-18-T-VP2。对其中的VP2 进行序列测定,并将测序结果同CPV-2 的其他几个基因变异型:CPV-d(CPV-2)、CPV-15(CPV-2a)、CPV-39(CPV-2b)的VP2 基因进行了序列比较。核苷酸同源性分别为核苷酸序列同源性分别为98.97%、98.75%、98.69%,推导的编码氨基酸同源性分别为98.12%、97.60%、97.60%。通过对重组质粒pMD-18-T-VP2 和真核表达载体pMel Bac C 进行酶切,将VP2 基因定向克隆至pMel Bac C 的HindⅢ和SalⅠ之间的多克隆位点上,命名为重组表达载体pMel Bac C-VP2。酶切、PCR 鉴定结果表明获得了CPV-VP2 基因与pMel Bac C 质粒的阳性重组子。纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA Bac-N-Blue 共转染昆虫细胞Sf9,3d 后收获重组病毒。重组杆状病毒DNA 分子的PCR 鉴定表明,获得了CPV-VP2 基因与杆状病毒DNA 的重组子,经过3 次蓝斑筛选,获得了纯化的重组杆状病毒。SDS-PAGEWestern-blotting 分析,表明CPV VP2 基因在杆状病毒表达系统中得到了表达。利用表达的CPV VP2 重组融合蛋白作为抗原,建立了CPV 血清抗体检测的间接ELISA方法。对ELISA 的反应条件进行优化,确定理想包被液是PBS(pH7.4),封闭液为0.5%BSA/PBS,血清稀释液为4%PEG6000/PBS,洗涤液为0.5M NaCl/0.5%Tween-20/PBS,ELISA最佳反应时间为1.5h,底物显色时间为5min。建立的间接ELISA 血清抗体检测方法为我国进行CPV 的诊断与血清学调查提供了一种技术手段。