脓毒症（Sepsis）指由于宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的多器官功能障碍。脓毒症是严重感染等临床急危重症患者的严重并发症之一,最终可以导致重症监护室内的患者多种重要器官的衰竭甚至患者的死亡。然而,脓毒症确切的发病机制尚未得知,缺乏特异性的生物标志物,也缺乏有效的治疗靶点。生物信息学是寻找疾病标志物和治疗靶点的重要手段。最近几十年来,基因芯片和高通量测序等全基因组分析技术的广泛应用,使快速评估疾病组织中所有基因的表达状况成为可能。全基因组分析所产生的海量数据促进了生物信息学新的模型和算法的产生,而这些新算法和新模型在炎症、心血管病以及癌症等疾病的分子机制考察、标志物寻找与靶点鉴定中扮演了重要的角色。本课题则从生物信息学出发,来研究脓毒症的发病机制、生物标志物和关键基因。本研究在第一部分中,使用生物信息学挖掘了脓毒症发生和发展过程中的关键基因、蛋白、转录因子和mi RNA。首先,本研究分析了多个来自世界各地的数据集,并筛选出不同人种的脓毒症患者全血中共有的差异表达基因（Different Regulated Genes,DEGs）。然后,通过使用Gene Oncology（GO）、Reactome、KEGG Pathway、PANTHER以及Bio Cyc等数据库,揭示了这些基因主要显著富集的生物学过程、细胞组分、分子功能以及通路。接着,本部分研究调用STRING数据库,将差异表达基因所对应的蛋白构建了蛋白-蛋白相互作用网络（Protein-Protein Interaction Network,PPI Network）,并使用Cytoscape等软件寻找脓毒症中具有潜在功能的蛋白密集作用区域以及关键节点蛋白。下一步,本部分研究通过调用ENCODE数据库构建了转录因子-基因作用网络,来寻找脓毒症中的关键转录因子。然后,本研究又使用了mi Records、mi RTar Base、Tar Base、mi R2Disease、HMDD、Phenomi R、SM2mi R、star Base、Pharmaco-mi R以及Epimi R等10个数据库,构建了mi RNA-基因作用网络,来筛选可能起到治疗作用的mi RNA。最后,本研究使用加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Correlation Network Analysis,WGCNA）算法,通过离群样本的去除、无尺度分布网络的构建以及基因聚类和模块构建等步骤,来筛选差异表达基因中与脓毒症的临床诊断关系最密切的基因。第一部分研究的结果显示,444个基因在跨地区、跨人种的脓毒症患者的全血中显著差异表达,其中包括MMP8、CD177等246个显著上调基因,以及SBK1、PRSS33等198个显著下调基因,这些基因主要显著富集在“固有免疫反应”等生物学过程、“T细胞受体复合物”等细胞组分、“MHC II类蛋白受体活性”等分子功能以及“中性粒细胞失调”等通路上。在蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络中,本研究共找到了ITGAM、LCK、TLR8、CD28、CCL5、CCR7、MMP9、CD2、ZAP70、CD4、CD3E等关键节点蛋白,这些关键节点蛋白往往由于与其他蛋白的相互作用较多而处于发病的核心位置,也更有可能作为药物的干预靶点。此外,在PPI网络中还找到了2个与“中性粒细胞脱颗粒”以及“免疫系统”等通路相关的密集作用区域。值得注意的是,精氨酸酶1（Arginase 1,ARG1）蛋白位于第一个密集作用区域中的核心位置,提示其与脓毒症的发病过程更相关。接着,本研究找到了TFDP1、IRF1等作用于上调基因的关键转录因子,以及WRNIP、HDGF等作用于下调基因的转录因子。鉴于诸多药物都是以转录因子为靶点,挖掘脓毒症相关的重要转录因子对其治疗具有重大意义。此外,本研究还找到了hsa-mir-218-5p、hsa-mir-193b-3p等特异性靶向上调DEGs的潜在治疗性的mi RNA,以及hsa-mir-192-5p、hsa-let-7b-5p等特异性靶向下调DEG的mi RNA。应用这些mi RNA或其反义核酸有助于维持脓毒症期间基因表达的稳态,以起到潜在的治疗作用。最后,通过WGCNA分析将差异基因的表达谱数据模块化,共得到了四个基因共表达模块以及膜联蛋白A3（Annexin A3,ANXA3）等15个与脓毒症临床诊断最密切的基因。值得注意的是,在本部分筛选出的关键节点蛋白、转录因子、mi RNA以及与临床诊断关系最密切的基因中,有诸多已有报道与脓毒症存在明确关联,这证实了研究方法的可靠性。总之,在第一部分中,整合了多种生物信息学的方法,系统、综合、全面地筛选到了多个与脓毒症相关的基因、蛋白、转录因子和mi RNA。这些发现可以促进对脓毒症病理机制的理解,并为脓毒症的诊断和治疗提供生物标志物和潜在治疗靶点。在第二部分中,本研究着重考察了精氨酸酶1（Arginase 1,ARG1）和膜联蛋白A3（Annexin A3,ANXA3）作为脓毒症生物标志物的性能及其机制。首先我们发现,ARG1是PPI网络筛选结果与WGCNA分析结果中的唯一共有基因,也位于PPI网络中第一个密集作用区域中的核心位置。这说明ARG1与脓毒症关系更加密切,更加具有作为生物标志物的潜力。接着,本研究使用了10个来自于不同地区（五个北美、四个欧洲、一个亚洲）、不同年龄（六个成人、四个儿童）和采用不同技术方法（八个基因芯片、二个转录组测序）的数据集,发现与健康对照或对照患者相比,无论人种、年龄或实验技术如何,脓毒症患者的外周血中ARG1转录本丰度都显著增加。接着使用受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic,ROC）曲线,证实了ARG1基因在保持较高特异性的同时,也可以达到很高的灵敏度,充分说明了其作为脓毒症生物标志物的潜力。然而,一个良好的生物标志物不仅要有效区分患者和健康对照,还要在疾病的精确诊断、严重程度判断以及预后预测等方面具有价值,因此我们接下来考察ARG1在这些层面的作用。本研究发现,第一,ARG1在脓毒性休克患者全血中的水平显著高于非脓毒性休克。由于两类休克具有相似的体征和症状,ARG1作为生物标志物在临床实践中对脓毒症病情的特异性诊断具有重要价值;第二,ARG1在严重脓毒症和后期因脓毒症而死亡的患者全血中的表达水平显著高于普通的脓毒症患者,这表明ARG1作为生物标志物有助于预测脓毒症的严重程度;第三,ARG1在对后续支持性治疗无响应的脓毒症患者中存在显著的高表达,这有助于预测脓毒症患者后期的治疗效果。这三点充分说明了ARG1作为生物标志物的良好性能。我们还在动物水平进行了盲肠结扎穿刺的脓毒症造模,也证实了脓毒症小鼠全血中ARG1的高表达。然后,本研究使用GSEA分析探索ARG1基因高表达的机制,结果显示,其高表达与淀粉和蔗糖代谢、鞘脂代谢、铁死亡等方面有关。此外,在上一部分中,由于WGCNA结果表明ANXA3基因与脓毒症临床诊断的关系非常密切,本研究也考察了该基因作为脓毒症生物标志物的潜力。与ARG1类似,ANXA3可以有效区分脓毒症患者和健康对照。但ANXA3仅在脓毒性休克患者全血中的表达高于心源性休克患者,而无法有效预测脓毒症的严重程度以及对支持性治疗是否存在响应等。在动物实验证实了ANXA3在脓毒症期间的全血中存在高表达之后,机制探索还表明,这种高表达与SNARE复合体相关。总之,第二部分详细考察了ARG1以及ANXA3这两个基因对脓毒症诊断、预后、对治疗的响应程度等层次上作为生物标志物的性能及应用价值,并分别从生物信息学层面研究了其机制。鉴于很多脓毒症的生物标志物都源于炎症反应,缺乏对脓毒症本身的特异性,且功能较为单一,ARG1作为脓毒症的“多功能”生物标志物将有助于弥补这一缺陷。第三部分的研究则着重于探索ANXA3在脓毒症中的作用。在第一部分通过WGCNA分析找到的与脓毒症关系最密切的前5个基因中,其余四个基因都已有明确实验表明与脓毒症具有明确的相关性乃至“因果性”关联,而仅有ANXA3与脓毒症的关系尚未有实验性的报道。此外,经过文献查阅,ANXA3可能有助于感染的清除与肝组织的修复。因此本研究选择探索ANXA3基因在脓毒症中的作用。在这一部分中,首先通过Western Blot确证了ANXA3蛋白在脓毒症全血中蛋白层面的高表达,然后使用免疫组化发现ANXA3蛋白在脓毒症小鼠的脾脏中表达显著升高,肺血管内皮处表达降低,而肝脏中本身表达较少,脓毒症造模后也未出现显著变化。接下来使用流式细胞术研究得知,ANXA3蛋白在脓毒症小鼠巨噬细胞、中性粒细胞、总髓系细胞以及B细胞上表达显著升高,而在脓毒症前、后的T细胞上均不存在表达。下一步,本研究构建了ANXA3基因敲除小鼠,并从DNA、m RNA和蛋白质三个层面验证了ANXA3的敲除。最后,本研究分别使用盲肠结扎穿刺（Cecal Ligation and Puncture,CLP）以及腹腔注射脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）的脓毒症模型,从器官功能、组织损伤、载菌量、细胞浸润以及生存率等层面探索了ANXA3基因在脓毒症中的作用。结果显示,在野生型脓毒症小鼠与ANXA3敲除的脓毒症小鼠之间,这些指标未显示出显著差异,这可能与ANXA3蛋白延长中性粒细胞寿命和增加炎症反应的“有害”作用,与清除细菌和修复组织损伤的“有益”作用这两方面相抵消有关。总之,这一部分的结果表明,ANXA3仅限于用作脓毒症的生物标志物,而不适合作为治疗靶点。综上所述,第一,本研究整合了多个生物信息学分析方法与数据,挖掘到了多个与脓毒症密切相关的基因、蛋白、转录因子和mi RNA。第二,本研究鉴定出了ARG1与ANXA3这两个脓毒症的潜在生物标志物,并考察了其在精确诊断、预后预测以及对治疗响应的预测等方面的性能。第三,本研究通过ANXA3基因敲除小鼠的构建,进一步探索了在CLP和LPS诱导的脓毒症中,ANXA3基因在器官功能、组织损伤、载菌量、细胞浸润以及生存率等层面的作用。这些发现可以加深对脓毒症发生和发展过程的理解,并有助于脓毒症的精确诊断和治疗。