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背景和目的内质网应激(ER stress,ER stress)是内质网内环境平衡紊乱时的应激反应,是机体细胞对内质网内蛋白蓄积的一种适应性应答方式。UPR是研究较深入的信号通路。它是指当缺氧、缺血再灌注损伤等因素导致内质网腔内未折叠蛋白或错误折叠蛋白增多时,应激信号PERK、ATF6、IRE-1由内质网膜传递到细胞核中,引起一系列特定靶基因的转录,通过减少蛋白合成,促进蛋白降解和增加分子伴侣合成的方式来帮助蛋白正确折叠,以维持细胞正常功能的一种自我保护性机制。ER stress与成体干细胞和肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)有着密切的关系。研究表明,ER stress是成体干细胞(如小肠干细胞、造血干细胞、黑色素干细胞等)自我更新、干性维持、增殖、存活等所必需的。ER stress在维持血液干细胞池的稳定性中起着重要作用。ER stress可以诱导结肠癌干细胞分化,提高结肠癌对化疗的敏感性。鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国华南地区高发的头颈部恶性肿瘤,其解剖部位深邃,很难进行手术切除,目前放疗是NPC的主要治疗手段,亟须开创新的治疗方法。绝大多数NPC属于低分化鳞癌,这就为研究实体肿瘤诱导分化治疗提供了一个独特模型,“诱导分化”理论如能引入实体肿瘤(如NPC)的临床治疗,将为患者带来福音。目前,ER stress在NPC中的研究尚未见报道。同样作为上皮来源的NPC细胞,是否也可以利用ER stress诱导分化。基于以上研究背景,本课题将进行ER stress诱导鼻咽癌细胞分化的实验研究。Hes1作为转录因子在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。近年来研究发现,Hes1基因可以负调控干细胞的不对称有丝分裂,维持其自我更新,通过某些干细胞和祖细胞的维持并通过Notch通路影响消化器官的发育,可作为结肠干细胞的一个标志。本课题组前期研究发现,在NPC临床组织标本中,与分化型非角化性癌相比,Hes1在未分化型癌中高表达,Hes1与NPC分化指标CK8、Involucrin在组织标本上的表达趋势相反;而与CK13表达趋势相同,在ATRA诱导的NPC细胞分化模型中,Hes1在NPC分化过程中呈下降趋势,这提示我们Hes1可能有抗NPC分化的作用。基于此,我们也有检测了 Hes1在ER stress诱导分化的NPC细胞中的表达水平。方法1.建立NPC细胞株ER stress模型1)确定 ER stress 诱导剂 Tm(Tunicamycin,Tm)和 Tg(Thapsigargin,Tg)最佳用药浓度及作用时间。2)应用qRT-PCR和Western blot方法分别从mRNA和蛋白水平检测NPC细胞株ER stress是否诱导成功。2.探讨ER stress是否可以诱导NPC细胞分化1)NPC细胞发生ER stress后细胞形态变化。2)肿瘤球培养和SP细胞比例检测评估ER stress对NPC CSCs的影响。3)qRT-PCR和Western blot检测NPC细胞发生ER stress时,NPC分化相关标志基因的表达水平。3.探讨ER stress诱导分化后的NPC细胞生物学特性变化1)应用CCK-8和平板克隆形成实验检测ER stress诱导分化后的NPC细胞体外增殖能力。2)应用划痕愈合实验、Transwell和Boyden实验检测ER stress诱导分化后的NPC细胞体外迁移力和侵袭力。3)SA-β-Gal染色检测ER stress对NPC细胞衰老的影响。4)流式细胞仪检测ER stress诱导剂对NPC细胞凋亡的影响。5)应用qRT-PCR和Western blot方法检测NPC细胞发生ER stress后上皮相关标志基因的表达水平。6)裸鼠皮下成瘤实验评估ER stress诱导分化后的NPC细胞体内成瘤能力。7)免疫组化检测裸鼠移植瘤组织标本中ER stress与增殖及分化相关标志基因的表达相关性。4.初步检测Hes1在ER stress诱导分化后的NPC细胞中的表达水平qRT-PCR和Western blot初步检测ER stress诱导分化后的NPC细胞Hes1的表达水平。结果1.NPC细胞ER stress模型的建立ER stress诱导剂的最佳作用浓度和作用时间,Tm1.0 μg/mL.24h;Tg 1.0 pM.24h。qRT-PCR 和 Western blot 检测显示,与对照组相比,ER stress诱导剂处理组ER stress信号通路分子伴侣GRP78显著高表达(P<0.05),PERK、ATF6和IRE-1通路不同程度激活。2.ER stress诱导NPC细胞分化NPC细胞发生ER stress后细胞形态由较低分化状态的铺路石样向较高分化状态的多边样转变。分化指标CK8和Involucrin在ER stress诱导分化的NPC细胞中高表达,而CK13低表达。SP侧群细胞比例显著减少(P<0.05)。3.ER stress诱导分化后的NPC细胞的生物学特性CCK-8和平板克隆形成实验检测显示,ER stress诱导分化后的NPC细胞体外增殖能力显著降低(P<0.05)。划痕愈合实验和Transwell实验结果显示,ER stress诱导分化后的NPC细胞体外迁移能力显著降低(P<0.05)。SA-β-Gal染色检测结果显示,ER stress诱导分化后的NPC细胞衰老明显增加(P<0.05)。流式细胞仪检测ER stress诱导剂对NPC细胞凋亡无影响(P>0.05)。qRT-PCR和Western blot检测显示,ER stress诱导分化后的NPC细胞上皮相关指标E-ca表达显著上调,间充质指标Vimentin则表达降低(P<0.05)。4.Hes1在ER stress诱导分化后的NPC细胞中的表达情况qRT-PCR和Western blot检测显示,ER stress诱导分化后的NPC细胞中Hes1表达显著降低(P<0.05)。结论1.成功诱导NPC细胞发生ER stress。2.ER stress可以诱导NPC细胞分化。3.ER stress诱导分化后的NPC细胞,干性、增殖及迁移能力显著降低,细胞衰老增加。4.ER stress诱导分化的NPC细胞中Hes1表达显著下调。