水牛（Bubalus bubalis）是我国南方地区特色的家畜,具有耐粗饲、耐湿、耐热、抗病、乳制品营养价值高等特点。我国是水牛养殖的第三大国,但水牛种群的生产性能较低,亟待通过品种改良提高其经济价值。公水牛可以将优良的遗传性状广泛稳定的遗传,是水牛品种改良的基础。精子发生与公水牛的生产性能息息相关,目前关于水牛的精子发生机制仍不清楚。蛋白质是生命活动的直接承担者,从蛋白质翻译和翻译后修饰层面研究精子发生将直接阐释其生理条件下的变化机制。因此,本研究借助蛋白质组学技术探究生精细胞和支持细胞的蛋白质表达和修饰水平的动态变化,为水牛雄性生殖生理的研究提供新的视角。本文的主要研究结果如下:一、水牛生精细胞、支持细胞蛋白质组和磷酸化蛋白质组表达谱的构建和分析。为了获得水牛精子发生的蛋白质调控机制,分别对水牛生精细胞和支持细胞进行蛋白质组学研究。通过对质谱数据的分析,成功构建水牛生精细胞和支持细胞蛋白质表达图谱,获得了高丰度蛋白质信息。利用生物信息学分析工具对生精细胞和支持细胞的蛋白质和磷酸化蛋白质进行生物学进程、分子功能和代谢通路的分析,富集到一批与精子发生相关的蛋白质和信号通路,发现剪接体相关蛋白质在精子发生过程中发挥重要作用。通过对磷酸化位点修饰的激酶分析,发现一批调控精子发生的蛋白激酶。利用STRING数据库分别构建生精细胞和支持细胞的蛋白质调控网络。通过上传原始数据到PRIDE质谱数据库,成功构建水牛生精细胞和支持细胞的蛋白质组公共数据库。二、水牛不同类型生精细胞定量蛋白质组和定量磷酸化蛋白质组的分析。精子发生是一个连续动态的过程,为了进一步获得水牛精子发生过程的蛋白质动态变化,开展了水牛不同类型生精细胞的定量蛋白质组学的分析。结果表明,成功分离出精原细胞、精母细胞和精子细胞,并获得差异表达蛋白质219种,差异表达磷酸化蛋白质71种。通过生物信息学分析发现差异蛋白质参与粘着斑、肌动蛋白细胞骨架等通路,差异磷酸化蛋白质参与RNA转运,粘附连接等通路。对差异蛋白质和差异磷酸化蛋白质在精子发生过程中表达趋势分析,获得了蛋白质动态表达图谱,发现了在精子发生的不同时期主要生物学进程的调控。通过激酶底物磷酸化位点网络分析,发现丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1活力最高,核纤层蛋白A/C受到最多激酶的调控,且AKT1催化LMNA发生磷酸化修饰。Western blot实验证实蛋白质在不同类型生精细胞的表达变化与质谱定量结果一致。通过免疫组织化学定位分析,发现异型组蛋白H2A2、DNA拓扑异构酶、核纤层蛋白A/C和波形蛋白在水牛睾丸中具有特异性的定位。三、AKT1激酶在睾丸中的功能及对LMNA磷酸化影响的研究。为了进一步验证磷酸化蛋白质组学数据中筛选到的蛋白激酶的功能及其催化底物的关系,开展了AKT1对睾丸细胞增殖、凋亡以及对LMNA磷酸化水平影响的研究。结果表明,抑制AKT1蛋白的功能降低睾丸细胞增殖率,诱导睾丸细胞凋亡,降低LMNA的S392位点的磷酸化水平。激活AKT1的功能增加睾丸细胞增殖率,抑制睾丸细胞凋亡,提高LMNA的S392位点磷酸化水平。说明AKT1激酶对水牛睾丸精子发生过程起到重要作用。综上所述,本研究探索了水牛支持细胞和生精细胞的蛋白质组信息,获得了参与水牛精子发生的蛋白质表达图谱及动态变化,完成了水牛精子发生相关的蛋白质组学的研究,为了解水牛精子发生的分子机制提供线索,为公畜的精子发生研究提供理论依据。