论文部分内容阅读
缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl)是一种淡水单细胞微藻，隶属于绿藻门Trebouxiophyceae纲。细胞呈球形或卵圆形，常以菲定形群体形式聚集生长。藻细胞能大量积累以三酰甘油(TAG)形式结合的花生四酸(arachidonic acid，AA)，尤其是在氮饥饿条件下培养14天后，AA最高含量达到总脂肪酸含壁的60％及藻体干重的20％(w/w)，具有潜在的开发利用价值。
本研究以λTriplEx2为载体，利用SMART(Switching Mechanism At 5’end of RNA Transcript)技术构建了缺刻缘绿藻cDNA文库，随机挑取了1942个克隆，并进行了单向一次性测序。采用生物信息学方法，对随机测序形成的表达序列标签(express sequence tags，ESTs)进行了初步分祈。结果表明，1942个克隆中有88个低质量克隆，剩余的1854条ESTs可聚类成596条非冗余序列(non-redundant sequences，NRSs)，其中126条由1384条ESTs产生，EST的冗余率为67.9％。在596条NRSs中，有30条是核糖体RNA基因，148条在蛋白质数据库中存在同源蛋白。其中，大部分与能量代谢、物质转换和蛋白质生物合成相关，还有一些与生长发育、信号转导、抗逆和防御以及物质运输相关。部分ESTs已经提交到GenBank数据库中，登录号分别为FE673534-FE673550、FF848254-FF848339和FG065107-FG065165。本研究为开展缺刻缘绿藻的功能基因克隆、分析和功能基因组学研究提供了条件。
根据莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和普通小球藻(Chlorella vulgaris)的omega-3脂肪酸去饱和酶(ω-3 FAD)氨基酸序列保守区设计简并引物(degenerate primers)，以总RNA为模板进行RT-PCR扩增，结果得到了一条650 bp的特异性条带。经克隆测序，并进行BLAST比对分析，发现该序列与莱茵衣藻ω-3 FAD基因cDNA序列的一致性达79％，与其编码的氨基酸序列相似性达89％，说明这条序列为缺刻缘绿藻ω-3 FAD基因cDNA片段。根据这条已知序列设计基因特异性引物(gene-specific primers，GSPs)，分别进行5’和3’RACE(cDNA末端快速扩增，rapid amplification of cDNA ends)，获得了5’和3’端的序列，经序列拼接，得到了ω-3 FAD基因cDNA全长序列2330 bp(GenBank登录号：EU658930)，开放阅读框(ORF)1308 bp，5’非编码区(5’UTR)107 bp，3’非编码区(3’UTR)912 bp，而且具有明显的polyA尾巴；经BLAST分析，发现与莱茵衣藻、普通小球藻、Chlorella sp．LKT-2007、杜氏盐藻(Dunaliella salina)等藻类的ω-3 FAD基因cDNA一致性分别为78％、73％、79％、74％。推测其编码的ω-3 FAD蛋白由436个氨基酸组成，大小为49.6 kD，等电点为7.85。该缺刻缘绿藻ω-3 FAD具有同源性ω-3FAD所共有的特性，如富含疏水性氨基酸，含有三个保守的组氨酸簇基序、一个脂肪酸去饱和酶结构域和两个长的а螺旋区，即两个跨膜区，圆次跨膜，属于膜整合型蛋白。