目的: 慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种具有气流受限特征的可以预防和治疗的疾病,气流受限不完全可逆、呈进行性发展,与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。除吸烟外,生物燃料(包括未经加工处理的木柴、农作物废料和动物粪便等)燃烧所导致的室内空气污染在COPD发病中的作用日益受到重视。全球疾病负担评估表明,使用生物燃料造成的空气污染是一项威胁全球公共卫生的重要问题,发展中国家农村地区最大的死亡负担主要是由室内污染暴露造成的。使用生物性燃料是发展中国家室内空气污染的主要污染源,是广大发展中国家农村妇女发生COPD的一个重要危险因素。儿童时期下呼吸道感染是COPD发病独立的危险因素。下呼吸道感染的主要病原体是病毒,尤其是腺病毒。与其他病毒感染不同,腺病毒往往在急性期感染后形成潜伏感染状态,病毒虽然停止复制但病毒DNA长期存在于宿主细胞内,并表达部分病毒蛋白,其中ElA蛋白是腺病毒潜伏感染后最主要表达的效应蛋白。COPD最主要的病理特征是累及肺组织和气道的慢性炎症,所涉及的发病机制主要包括：炎症机制、氧化/抗氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及凋亡机制。我们推测：腺病毒潜伏感染持续表达E1A蛋白,可能通过某些机制参与COPD的发生、发展过程。本研究拟通过观察生物燃料烟雾对动物肺部及全身的影响来探讨生物燃料在COPD发生发展中所起的作用。并构建了腺病毒潜伏感染持续表达E1A蛋白的动物模型,观察了腺病毒感染对木材锯末和谷壳所产生的烟雾导致的豚鼠肺部炎症及氧化/抗氧化平衡的影响,探讨腺病毒潜伏感染在COPD发病机制中的作用,为进一步揭示COPD发病机制、寻找有效的COPD防治方法打下坚实基础。 方法: 一.肺部被腺病毒潜伏感染并持续表达ElA蛋白的豚鼠模型的构建 用含10％胎牛血清的MEM培养基培养A549细胞,细胞长为单层且状态较好时,开始接种野生型腺病毒5型(Ad5)。在接种后第2d～5d收毒。用腺病毒纯化试剂盒过滤纯化腺病毒,TCID50实验测定病毒滴度,0.01 M PBS液稀释腺病毒纯化液100倍。46只豚鼠随机分为两组。取0.1 ml腺病毒稀释液鼻腔接种一组,另一组用0.1ml无菌PBS液鼻腔接种作为对照。两组豚鼠隔离饲养22d,腺病毒复制停止。采血用PCR的方法检测ElA基因是否存在来区分Ad感染是否形成潜伏感染,初步鉴定后进行下一步实验。实验结束后,取豚鼠左肺下叶组织提取基因组DNA,用PCR的方法检测肺组织是否存在ElA基因,右肺经多聚甲醛固定后常规方法脱水、石蜡包埋、切片,通过PowerVision二步法免疫组化的方法检测肺组织中ElA蛋白的表达。 二.木材锯木与谷壳烟雾暴露 经采血检测ElA基因的两组豚鼠根据结果再各随机分为两组,分别进行烟雾暴露和假暴露。将烟雾暴露组豚鼠置于烟室内,将5g锯末和5g谷壳混匀闷燃。用多组份烟气分析仪实时监测箱内O2、CO、S2和NO浓度,动物每次暴露30min,每天两次,共21d。烟雾暴露时动物可在箱内自由取食饮水。对照组动物同样置于烟室内,除吸入新鲜空气假暴露外,其它操作及饲养条件同烟雾暴露组动物一致。 三.标本收集 对豚鼠左肺进行肺泡灌洗,收集BALF并离心,取上清-70℃保存备用；细胞沉淀用于细胞计数及涂片分类计数。灌注完毕后结扎左侧主支气管,取左肺组织匀浆离心,取上清-70℃保存备用。通过右侧主支气管向右肺灌注4％多聚甲醛固定24h后,在右肺尖叶及膈叶相同位置取肺组织块,常规方法脱水、石蜡包埋、切片(5μm)、HE染色。 四.肺组织病理形态学检测 按照文献报道方法评价肺组织病理学改变情况。采用JD801形态学显微图像分析系统,以单位面积肺泡数、平均肺泡面积反映肺气肿样改变；以单位长度的管壁平滑肌层面积表示平滑肌层厚度。 五.BALF中IL-8、IL-6、ICAM-1浓度的测定 用考马斯亮兰法测定BALF中总蛋白含量,采用美国Rapidbio(R.B)公司提供的豚鼠IL-8、IL-6及ICAM-1 ELISA检测试剂盒,用双抗夹心ELISA法定量检测豚鼠BALF中IL-8、IL-6、ICAM-1的浓度,结果除以BALF中总蛋白含量进行标化。六.氧化损伤指标的测定用比色法测定肺组织匀浆及血清中的GSH-PX、MDA、SOD、CAT、总抗氧化能力的含量及BALF中的MDA、SOD、总抗氧化能力的含量,采用考马斯亮兰比色法测定肺组织匀浆及BALF中总蛋白含量。肺组织匀浆及BALF中所测结果分别除以肺组织匀浆和BALF中总蛋白含量进行标化。 结果: 一.确定腺病毒潜伏感染的结果 电泳结果显示腺病毒感染组豚鼠肺组织基因组可见清晰目的条带,而假感染组未见日的条带,与血液内检测结果一致。腺病毒感染组豚鼠肺组织切片免疫组化结果可见不同程度的胞核内褐色颗粒沉积,表示有ElA蛋白表达,而假感染组未见阳性表达,说明感染组豚鼠肺部成功感染腺病毒并有ElA蛋白表达。 二.肺泡灌洗液中白细胞计数及分类计数结果 生物燃料烟雾暴露使豚鼠BALF中白细胞总数及中性粒细胞比例明显增高,淋巴细胞比例相对下降,对巨噬细胞比例和嗜酸性粒细胞比例无影响。腺病毒感染使豚鼠BALF中白细胞总数增高,对中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞分类比例无影响。腺病毒感染和烟雾暴露对豚鼠BALF中白细胞总数的增高有交互作用,而对各种细胞分类比例的影响无相乘的交互作用。 三.病理观察和形态定量分析 病理切片HE染色结果可见腺病毒感染+生物燃料烟雾暴露组动物小气道上皮呈锯齿状增生增厚,部分上皮脱落,支气管壁增厚,大量炎性细胞浸润,管腔有炎性细胞渗出,肺泡结构紊乱,肺泡壁断裂或因炎性细胞浸润变厚,肺泡腔扩大,部分融合成肺大疱。单纯腺病毒感染组动物小气道黏膜上皮完整,纤毛未见黏连脱落,管壁规整未见增厚,管腔内可见少量渗出物,肺泡腔未见病理性扩大,肺间质血管可见部分充血。单纯生物燃料烟雾暴露组动物小气道上皮呈锯齿状增生增厚,支气管壁增厚,伴炎性细胞浸润。肺泡结构紊乱,肺泡壁断裂,肺泡腔扩大,部分融合成肺大疱。 生物燃料烟雾暴露使豚鼠平均肺泡面积增大,肺小动脉平滑肌及支气管平滑肌增厚。腺病毒感染豚鼠平均肺泡面积肺小动脉平滑肌及支气管平滑肌的厚度无影响。两者无相乘的交互作用。四.肺泡灌洗液中IL-8、IL-6、ICAM-1的浓度生物燃料烟雾暴露使豚鼠BALF中IL-8、IL-6、ICAM-1浓度增高,腺病毒感染使豚鼠BALF中IL-8及ICAM-1浓度增高,对IL-6无显著影响。腺病毒感染对生物燃料烟雾暴露使豚鼠BALF中IL-8、ICAM-1浓度增加有协同作用,而对豚鼠BALF中IL-6无协同作用。 五.氧化抗氧化失衡相关指标结果 生物燃料烟雾暴露使豚鼠肺组织匀浆及血清中GSH-PX、GSH、SOD、CAT、总抗氧化能力显著降低,MDA显著升高。腺病毒感染使豚鼠肺组织匀浆及血清中GSH-PX、GSH、SOD、总抗氧化能力显著降低,使豚鼠肺组织匀浆CAT降低,MDA升高。生物燃料烟雾暴露和腺病毒感染的交互效应使豚鼠肺组织匀浆GSH-PX降低及血清中GSH-PX、GSH降低,腺病毒感染生物燃料烟雾暴露导致的豚鼠肺组织匀浆及血清中SOD、CAT、总抗氧化能力的降低和MDA的升高具有协同作用。 生物燃料烟雾暴露使豚鼠BALF中SOD和总抗氧化能力显著降低,MDA显著升高。腺病毒感染使豚鼠BALF中SOD降低,MDA升高。两者虽无相乘的交互效应,但是有协同作用。 结论: 1.生物燃料烟雾可引起豚鼠肺部炎症及氧化/抗氧化失衡,肺泡腔扩大,出现支气管炎及肺气肿样改变,并引起支气管和肺小动脉壁增厚,这可能是导致气流阻塞、并最终引起COPD主要因素。 2.腺病毒潜伏感染能够放大生物燃料烟雾所引起的豚鼠肺部炎症及氧化/抗氧化失衡。