神经胶质瘤是一种恶性程度极高、侵袭性极强的肿瘤,多原发于颅内,因其发病机制复杂、发病部位特殊,早期诊断较为困难,多数患者在诊断时已发展至晚期。目前,临床上神经胶质瘤主要的治疗手段为手术和放化疗,但均难以取得理想的效果,临床预后极差,因此,胶质瘤的治疗目前仍是神经外科领域面临的巨大挑战之一。近年来,随着“精准医学”概念的提出,靶向治疗为神经胶质瘤患者提供了一种潜在的治疗手段,为改善神经胶质瘤患者的预后提供了新的可能。因此,目前寻找神经胶质瘤发生、发展过程中的关键分子是神经外科领域的研究热点,其有可能为神经胶质瘤患者的早期诊断和靶向治疗提供新的靶点。中介体复合物（Mediator complex,MED）最早在酵母中发现,近年来研究发现在人细胞中也有MED的存在,并且目前为止研究发现组成人类MED的蛋白有20多种。目前学者们公认肿瘤的发生、发展是由多种基因异常表达的结果,而现有研究发现MED在基因转录过程中发挥着重要的调控作用,其在转录过程中通过与RNA聚合酶Ⅱ一起构成RNA聚合酶Ⅱ全酶,一方面起到连接转录因子和前期复合物的桥梁作用,另一方面还可以通过与转录因子或RNA聚合酶Ⅱ最大亚基的C末端相互作用发挥对靶基因转录的调控作用。中介体复合物27（MED27）是MED中重要的一种,目前研究发现其广泛存在于人体的各个器官和组织中,而且没有组织特异性,在转录起始阶段中发挥着催化酶的作用。但是,就目前为止,MED27在人类疾病中的研究尚少,发挥的确切生物学功能尚不清楚。先前有研究通过敲低MED家族蛋白（包括MED27）发现人类免疫缺陷病毒-1（Human Immunodeficiency Virus-1,HIV-1）的复制能力明显降低,但HIV-1感染细胞的存活能力无明显变化,进而推测:该家族蛋白（包括MED27）可能参与了 HIV-1的转录过程。也有研究发现MED27可与甲状腺激素受体以及多种因子（包括转录因子和辅因子）相互作用,发挥甲状腺激素受体的作用。此外,在黑色素瘤中的研究发现:MED27可通过激活NF-κB/iNOS信号通路来促进黑色素瘤的生物学进展,因此,进一步推测:MED27有可能作为黑色素瘤早期诊断和术后治疗的生物学标记物。然而,到目前为止,MED27在人类神经胶质瘤中的生物学功能及其相关分子机制目前尚无报道。我们课题组已专注神经胶质瘤的分子研究多年,因此,我们拟在前期实验基础和现有文献的报道的基础之上,进一步探讨MED27在神经胶质瘤中的生物学功能及其潜在的分子机制。目的:1、探讨MED27对U87神经胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭生物学行为的影响;2、探讨NF-κB/iNOS信号轴是否参与了 MED27对U87神经胶质瘤细胞生物学行为的调控过程。方法:第一部分:通过qRT-PCR检测MED27mRNA的表达水平来评价MED27敲低的U87胶质瘤细胞模型是否构建成功1、建立该实验所需的细胞模型1.1在含10%胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）的培养基中培养第2代到8代U87胶质瘤细胞系直至细胞生长状态良好,建立本实验所需的基础细胞模型。1.2将处于以上生长状态的U87胶质瘤细胞系,随机分成三组,分别通过转染 MED27 小干扰 RNA（Small interfering RNA,siRNA）、MED27 阴性对照siRNA和继续正常培养U87胶质瘤细胞,建立MED27敲低U87细胞模型、阴性对照U87细胞模型以及空白对照U87细胞模型（基础细胞模型）。2、RNA水平评价细胞模型是否建立成功1.3 qRT-PCR检测MED27敲低U87细胞模型、阴性对照细胞模型以及空白对照细胞模型中MED27mRNA的表达水平,评价模型是否建立成功。第二部分:通过Western blotting检测MED27蛋白的表达水平来评价MED27敲低的U87胶质瘤细胞模型构建成功1.1 在含10%胎牛血清的培养基中培养第2代到8代U87细胞系直至细胞生长状态良好,建立本实验所需的基础细胞模型。1.2 将处于以上生长状态的U87胶质瘤细胞系,随机分成三组,分别通过转染MED27 siRNA、MED27阴性对照siRNA和继续正常培养U87胶质瘤细胞,建立MED27敲低U87细胞模型、阴性对照U87细胞模型以及空白对照U87细胞模型（基础细胞模型）。2、蛋白水平评价细胞模型是否建立成功1.3 Western blotting检测MED27敲低U87细胞模型、阴性对照细胞模型以及空白对照细胞模型中MED27蛋白的表达水平,评价模型是否建立成功。第三部分:检测MED27对U87胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭生物学行为的影响1、构建细胞模型通过上述siRNA转染技术,构建MED27敲低U87胶质瘤细胞模型、阴性对照U87胶质瘤细胞模型以及空白对照细胞模型。2、敲低MED27后,检测U87胶质瘤细胞增殖能力的变化在转染siRNA后,通过MTT实验比较MED27敲低U87胶质瘤细胞模型组和阴性对照U87胶质瘤细胞模型组之间U87胶质瘤细胞增殖能力的变化。3、敲低MED27后,检测U87胶质瘤细胞凋亡的变化在转染siRNA后,通过使用Caspase 3活性检测试剂盒来检测和比较MED27敲低U87胶质瘤细胞模型组和阴性对照U87胶质瘤细胞模型组之间U87胶质瘤细胞凋亡的变化。4、敲低MED27后,检测U87胶质瘤细胞侵袭能力的变化在转染siRNA后,通过Transwell实验来观察和比较MED27敲低U87胶质瘤细胞模型组和阴性对照U87胶质瘤细胞模型组之间U87胶质瘤细胞侵袭能力的变化。第四部分:MED27影响U87胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭能力生物学行为的潜在机制1、敲低U87胶质瘤细胞的MED27后,转录因子NF-κB的表达变化在转染siRNA后,通过Western blotting检测和比较MED27敲低U87胶质瘤细胞模型组和阴性对照U87胶质瘤细胞模型组中转录因子NF-κB的变化。2、U87细胞中MED27的表达水平对iNOS的影响在转染siRNA后,通过Western blotting检测比较MED27敲低U87胶质瘤细胞模型组和阴性对照U87胶质瘤细胞模型组中转录因子iNOS的变化。结果:第一部分:MED27siRNA转染U87胶质瘤细胞后,MED27mRNA的表达水平明显降低在成功构建上述细胞三种U87胶质瘤细胞模型后,我们通过qRT-PCR实验发现:与阴性对照组相比,在U87胶质瘤细胞中转染MED27 siRNA可显著降低其MED27 mRNA的表达水平（P<0.05）;同时,与空白对照组相比,阴性对照组对U87胶质瘤细胞中MED27 mRNA的表达则无明显影响（P>0.05）。第二部分:MED27siRNA转染U87胶质瘤细胞后,MED27蛋白表达水平明显降低在成功构建上述细胞三种U87胶质瘤细胞模型后,我们通过Western blotting实验发现:与阴性对照组相比,在U87胶质瘤细胞中转染MED27 siRNA可明显降低其MED27蛋白的表达水平（P<0.05）;同时,与空白对照组相比,阴性对照组对U87胶质瘤细胞中MED27蛋白的则表达无明显影响（P>0.05）。第三部分:MED27siRNA转染U87胶质瘤细胞后可降低其增殖和侵袭能力,促进其凋亡1、siRNA敲低MED27后,U87胶质瘤细胞的增殖能力明显下降在成功构建上述细胞三种U87胶质瘤细胞模型后,通过MTT实验我们发现:与阴性对照组相比,U87胶质瘤细胞中转染MED27 siRNA后,其增殖能力明显下降（P<0.05）。2、siRNA敲低MED27后,U87胶质瘤细胞Caspase 3的生物学活性显著增强在成功构建上述细胞三种U87胶质瘤细胞模型后,通过使用Caspase 3活性检测试剂盒我们分析发现:与阴性对照组相比,U87胶质瘤细胞中转染MED27 siRNA后,可明显增加Caspase 3的生物学活性（P<0.05）。3、siRNA敲低MED27后,U87胶质瘤细胞的侵袭能力明显增强在成功构建上述细胞三种U87胶质瘤细胞模型后,通过Transwell实验我们观察发现:与阴性对照组相比,U87胶质瘤细胞中转染MED27 siRNA后,其侵袭能力明显下降（P<0.05）。第四部分:siRNA转染U87胶质瘤细胞后,NF-κB和iNOS的表达显著降低1、敲低MED27后,U87胶质瘤细胞中NF-κB的表达降低在成功构建上述细胞三种U87胶质瘤细胞模型后,通过Western blotting检测我们发现:与阴性对照组相比,U87胶质瘤细胞中转染MED27 siRNA后,其NF-κB的表达明显降低。2、敲低MED27后,U87胶质瘤细胞中iNOS的表达降低在成功构建上述细胞三种U87胶质瘤细胞模型后,通过Western blotting检测我们发现:与阴性对照组相比,U87胶质瘤细胞中转染MED27 siRNA后,其iNOS的表达明显降低。结论:1、通过功能实验,我们初步发现:MED27可抑制U87胶质瘤细胞的凋亡、促进其增殖和侵袭能力。2、通过机制实验,我们进一步推测:在U87胶质瘤细胞中,MED27发挥其抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和侵袭能力有可能是通过进一步激活NF-κB/iNOS信号通路来实现的。3、综合本研究所有实验结果,我们初步推测:MED27有可能是胶质瘤发生、发展过程中较关键的生物学标记物,发挥着癌基因的作用,有可能成为胶质瘤靶向治疗的新靶点。