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背景ESE3（ETS的同源因子/上皮特异性ETS因子家族成员3,EHF）是E26特定转换的（ETS）超级家庭的成员之一,主要在上皮组织中表达,在细胞分化和肿瘤进展中发挥着重要作用[1-2]。胰腺导管腺癌（PDAC）是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤,其最显著的特点是早期转移和化疗耐药[3]。PDAC具有密集的基质,富含白细胞,且主要是骨髓来源的细胞。这些髓样细胞是非均质的,主要包括单核系骨髓源性的抑制细胞及粒系骨髓源性的抑制细胞（Mo-和Gr-MDSC）[4]。这些细胞在骨髓中产生的,通过肿瘤细胞及其间质细胞来源的趋化因子被招募至肿瘤微环境中,进而促进肿瘤的生长[5-7]。近来,多项研究发现mo-MDSC在多种肿瘤中发挥免疫抑制作用,然而尚未有人报道在胰腺癌中ESE3对mo-MDSC的影响以及其对胰腺癌的影响作用。在前期工作中我们发现:与正常胰腺组织或胰腺癌导管腺癌（PDAC）的癌旁组织相比,在PDAC癌组织中mo-MDSC浸润比例明显增高,同时mo-MDSC会对肿瘤细胞产生反作用。因此,本课题旨在:（1）探讨ESE3与mo-MDSC的相关性,并明确其调控机制;（2）并进一步探索mo-MDSC对胰腺癌肿瘤细胞的反作用。从而从临床病例资料水平,细胞水平,动物水平来确定ESE3对mo-MDSC的调控及其对胰腺癌恶性的影响。方法1.对胰腺导管腺癌手术组织标本进行mo-MDSC流式检测及ESE3、CXCL1的免疫组化染色,分析胰腺导管腺癌中ESE3表达水平和mo-MDSC浸润比例的相关性。2.动物实验:构建PANC02细胞空载及过表达ESE3的稳定转染细胞系,在C57/BL小黑鼠皮下注射PANC02空载及其过表达ESE3的稳定转染细胞系,同时设置一平行给药组,即:分别对PANC02空载及其过表达ESE3组小鼠给与Anti-Gr1进行mo-MDSC的清除,两周后处死小鼠,然后收集瘤体,研磨剪碎瘤块,收集肿瘤单个细胞,并进行流式抗体染色,检测mo-MDSC及干性在组间的百分比改变。3.通过蛋白印迹杂交技术（Western blotting）的方法检测胰腺癌细胞系ESE3蛋白的基础表达水平,在此基础上构建两种过表达及降表达ESE3的稳转细胞系;用Western blotting方法检验稳系细胞中ESE3与IL-6及CXCL-1在蛋白水平的关系。并通过WB明确mo-MDSC反作用于肿瘤细胞之后的肿瘤细胞相应EMT及干性相关分子的变化。4.使用人外周血淋巴细胞分离液从人的抗凝全血中分选出外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs）并通过磁珠分选的方法从单个核细胞中分选出mo-MDSC的前体细胞（CD14阳性的单核细胞）。将经分选之后的细胞与胰腺癌细胞及其相应稳定转染细胞系进行共培养,共培养5天后,使用流式的方法对共培养的CD14+单核细胞进行CD14,CD33,CD11b及HLA-DR染色,检测成功诱导的mo-MDSC的比例,并进一步明确其与ESE3的关系。。进而将胰腺癌细胞及其稳系细胞所诱导出的mo-MDSC与胰腺癌肿瘤细胞共培养5天,以看mo-MDSC对胰腺癌肿瘤细胞的反作用。5.通过ELISA验证肿瘤细胞ESE3表达水平对其CXCL1分泌量的影响,并通过RT-PCR验证二者在mRNA水平的关系。6.利用CHIP实验验证ESE3对CXCL-1的直接调控关系。结果1.ESE3在胰腺癌中的表达水平及与mo-MDSC数量的关系。收集10例新鲜胰腺导管腺癌组织标本,利用免疫组化方法对组织标本进行ESE3免疫组化染色,并通过流式细胞术检测所浸润CD14+/HLA-DRlow/-/CD33+/CD11b+mo-MDSC比例,发现ESE3表达水平与mo-MDSC浸润比例两者之间呈现明显的负相关,且有统计学意义。2.动物实验验证ESE3蛋白的表达情况与肿瘤组织中mo-MDSC数量的关系。小鼠皮下成瘤模型中,给与PANC02稳定过表达ESE3细胞皮下注射组的小鼠肿瘤组织中浸润的mo-MDSC的比例显著低于对照组。同时,给与mo-MDSC清除之后,瘤体的干性比例总体降低,但是在PANC02空载对照组与ESE3过表达组之间没有明显差别,且无统计学意义。3.体外共培养联合流式细胞术验证ESE3表达引起mo-MDSC数量变化的机制。实验结果发现胰腺癌细胞或对应上清会引起外周血单个核细胞（PBMC）的趋化改变,而且相对于对照组而言,过表达ESE3组相应趋化数目明显减少,而ESE3降表达会引起趋化增强。同时ESE3的改变会影响CD14+单核细胞向CD14+/HLA-DRlow/-/CD33+/CD11b+的mo-MDSC诱导转变,而且与对照组相比ESE3高表达组相应诱导比例降低,而ESE3低表达对应诱导增多。进而将胰腺癌细胞及其对应稳系细胞所诱导出的mo-MDSC与胰腺癌肿瘤细胞共培养,发现一方面mo-MDSC会增强肿瘤细胞的干性及EMT;另一方面,ESE3过表达后的细胞所诱导出的mo-MDSC对相应肿瘤细胞的干性及EMT的增强程度减弱。4.ESE3与IL6及CXCL1相关性的确定。通过Western blotting确证,它们在蛋白水平是有关系的,即ESE3过表达后IL6及CXCL1的表达量明显下降;而ESE3降表达后会引起IL6及CXCL1的蛋白水平明显升高。之后通过ELISA实验明确,ESE3的表达水平与胰腺癌细胞CXCL1的蛋白分泌水平也呈现显著负相关;同时免疫组化染色证实,在胰腺导管腺癌组织中,ESE3可以与CXCL1的表达进行共定位,而且二者也呈现显著负相关关系。5.通过染色质免疫共沉淀（ChIP）实验发现在CXCL1的启动子区有两个ESE3的结合位点。结论1.ESE3表达水平与mo-MDSC在胰腺癌组织中的浸润比例呈显著负相关。2.ESE3可以直接结合到CXCL1启动子区的结合位点,进而调控CXCL1的转录和翻译。3.ESE3通过负调控CXCL1抑制PBMC在肿瘤局部的趋化,使得mo-MDSC的诱导前体细胞减少;同时ESE3通过直接抑制IL6的转录及翻译,减少IL6向细胞外释放,进而抑制了PBMC向mo-MDSC的诱导转变,在一定程度上可以减轻胰腺癌组织中的免疫逃逸现象。4.胰腺癌细胞所诱导的mo-MDSC会反作用于肿瘤细胞,反作用效果表现为:肿瘤细胞EMT及干性增强,同时更重要的是,ESE3高表达会逆转这一增强效应。