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背景:蛋白质在体内由于错误折叠而形成淀粉样聚集会导致一系列蛋白质构象病,如2型糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病及其他一些神经系统退行性疾病。在2型糖尿病患者胰岛中及胰岛移植后胰岛β细胞内外常见淀粉样蛋白聚集,这种淀粉样蛋白聚集的主要成分为人胰岛淀粉样多肽(hIAPP),hIAPP形成的淀粉样聚集被认为是造成2型糖尿病及胰岛移植物失活的重要原因之一。因此研究hIAPP的聚集性及对胰岛β细胞功能的损害,探讨如何减少胰岛中错误折叠的hIAPP聚集正日益受到国内外学者的重视。人胰岛淀粉样多肽由37个氨基酸组成,在胰岛细胞中的合成及分泌过程与胰岛素同步。hIAPP在生理状态下与胰高血糖素、胰岛素共同调节和维持人体血糖平衡;而在病理状态下,由于hIAPP的结构具有极强的自我聚集倾向,聚集过程形成的寡聚体及纤维体会对β细胞造成功能损害,导致β细胞死亡。有研究提出hIAPP可能由于芳香族残基的π-π相互作用,导致hIAPP的相互作用而形成淀粉样纤维沉积,所以含有芳香族氨基酸较多的区域也是造成hIAPP聚集的关键区域。目前减少hIAPP聚集的方法主要包括以下3方面:降低体内hIAPP的表达;提高错误折叠hIAPP的清除率;增加hIAPP的稳定性及抑制其聚集。国内外报道有很多能够抑制hIAPP聚集的抑制剂,主要包括某些小分子化合物、金属离子、自噬激活剂、分子伴侣及短肽类抑制剂。其中短肽类抑制剂与易于形成错误折叠的蛋白质发生构象改变的关键区域部分同源,能够特异性识别并结合靶蛋白的关键位点,并且可设计成携带某些特定的更易与靶蛋白结合的基团,和稳定靶蛋白构象的结构不向β折叠结构转变的基团,抑制聚集效果好,细胞毒性作用小,易于合成,越来越受到国内外学者的重视。目前国内外关于抑制hIAPP聚集的短肽类抑制剂研究较少,本研究根据以往研究的设计思路优化设计全新的8条短肽,并在缓冲液中验证他们抑制hIAPP聚集的效果,筛选出一条有效的短肽抑制剂FLPNF,并利用高表达hIAPP的大鼠胰岛素瘤细胞系进行研究,明确FLPNF对细胞内hIAPP聚集的影响,及对细胞凋亡及胰岛素分泌功能的影响,及其相关的分子机制。对临床研发治疗2型糖尿病及保护胰岛移植物功能的药物具有一定的意义。方法:1、根据hIAPP聚集的关键区域,优化设计并合成8条短肽,在PBS缓冲液环境中,通过ThT染色法筛选出有效的短肽;通过ThT染色检测短肽在缓冲液中抑制hIAPP聚集的量效关系;并进一步通过透射电子显微镜检测最佳浓度下短肽抑制hIAPP聚集的效果。2、通过ThT染色法观察过表达hIAPP的细胞系hIAPP-INS1细胞内及细胞膜hIAPP的聚集情况;通过Annexin V-PI染色法检测hIAPP-INS1细胞的凋亡情况;通过Elisa法检测hIAPP-INS1细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能;构建N端FITC标记的短肽,通过共聚焦显微镜及流式细胞仪检测短肽进入细胞的能力;通过ThT染色法观察细胞环境下,短肽对hIAPP-INS1细胞内及细胞膜hIAPP聚集的影响;通过Annexin V-PI染色法检测短肽对hIAPP-INS1细胞凋亡的影响;通过Elisa法检测短肽对hIAPP-INS1细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能的影响。3、运用生物膜干涉分析法明确FLPNF与hIAPP是否存在结合;通过酶活性测定法检测FLPNF对hIAPP-INS1细胞脑啡肽酶活性的影响,及ThT染色法明确FLPNF是否通过影响脑啡肽酶活性减少hIAPP的聚集。结果:1、短肽的设计、合成及在缓冲液中对hIAPP聚集的影响:(1)根据hIAPP形成聚集的关键区域,优化设计并合成8条短肽,通过软件预测使其均能够达到良好的理化特性;(2)在PBS缓冲液环境中,FLPNF可明显抑制hIAPP形成聚集;(3)FLPNF在PBS缓冲液中的最佳抑制浓度为与hIAPP摩尔比为10:1。2、短肽FLPNF对hIAPP-INS1细胞内hIAPP聚集的影响及对细胞凋亡及胰岛素分泌功能的影响:(1)与空转染慢病毒的CON-INS1细胞及过表达rIAPP的rIAPP-INS1细胞相比,过表达hIAPP的hIAPP-INS1细胞胞内及胞膜hIAPP聚集明显增加,凋亡比例明显增加,高糖刺激下的胰岛素分泌量减少;(2)FLPNF可在hIAPP-INS1胞内分布,说明FLPNF具有进入细胞的能力。(3)在细胞环境下,FLPNF能够明显抑制hIAPP-INS1细胞内及细胞膜hIAPP聚集,在200μM浓度下效果最佳;FLPNF可以显著降低hIAPP-INS1细胞凋亡比例并在一定程度上改善hIAPP-INS1细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌功能。3、短肽FLPNF降低hIAPP-INS1细胞内hIAPP聚集的分子机制研究:(1)FLPNF通过直接结合hIAPP抑制hIAPP形成聚集;(2)在hIAPP-INS1细胞中,FLPNF还可增加细胞的脑啡肽酶活性,从而促进hIAPP的降解。结论:短肽FLPNF能够进入hIAPP-INS1细胞内,在缓冲液环境及细胞环境中均可以抑制hIAPP形成聚集,并且通过抑制hIAPP聚集,减少hIAPP-INS1细胞凋亡,改善细胞的胰岛素分泌功能。FLPNF通过直接与hIAPP结合抑制hIAPP形成聚集,还可增强hIAPP-INS1细胞的脑啡肽酶活性,从而促进hIAPP的降解。可作为有效抑制hIAPP聚集的新型短肽抑制剂。