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目的探索Toll样受体(Toll Like Receptor,TLR)-3和-4在骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)成软骨分化的过程中对蛋白多糖和II型胶原蛋白形成的影响及机制。方法用Ficoll密度梯度离心法分离SD大鼠BMSCs,并进行传代扩增。流式细胞术检测细胞表面标志物CD34、CD44、CD54、CD90的表达进行细胞鉴定。取活力好的第3代BMSCs作为实验对象,在正式分组干预前,首先以Western blot法检测蛋白多糖和II型胶原的表达,作为后续试验的比较基线。再将BMSCs随机分为空白组、TLR-3激活组、TLR-4激活组,分别以PBS、TLR-3激动剂(Poly[I:C],SIGMA P9582-5MG 1μg/ml)、TLR-4激动剂(LPS,SIGMA L2630-10MG1μg/ml)处理后。三组细胞均进行成软骨诱导分化培养。培养第14天,以阿利新蓝染色检测蛋白多糖的形成,以免疫荧光及Western blot法检测II型胶原的表达,以实时荧光定量PCR检测Sox-9的表达。结果以Ficoll密度梯度离心法成功分离得到成纤维样贴壁生长的细胞,流式细胞技术检测表面标志物表达,结果为CD34(—)、CD44(+)、CD54(+)、CD90(+),符合BMSCs表面标志物表达特点,证实分离培养所得细胞为大鼠BMSCs。分组处理前,细胞并不表达蛋白多糖及II型胶原,BMSCs在化学组成上并不表现出成软骨细胞的特性。经过2周成软骨分化诱导培养,空白组、TLR-3激活组和TLR-4激活组均生成了蛋白多糖,阿利新蓝染色均为阳性,计数并比较发现,三组间阳性细胞数差异无统计学意义(F=0.628,P=0.547>0.05)。免疫荧光及Western-blot结果显示,三组均表达II型胶原,但空白组表达明显低于TLR-3激活组和TLR-4激活组(t3=3.993,P3=0.003<0.05;t4=7.650,P4=0.000<0.05),而后两组间无明显差异(t=0.934,P=0.372>0.05)。PCR结果显示,TLR-3和TLR-4激活组Sox-9相对表达量分别是对照组Sox-9表达量的2.2倍和2.14倍,差异具有统计学意义(t3=4.47,P3=0.00<0.05;t4=3.61,P4=0.02<0.05),而前两组之间Sox-9的表达量无明显差异(t=1.12,P=0.27>0.05)。结论经过成软骨诱导分化培养,大鼠BMSCs能够形成基质蛋白多糖及II型胶原,初步具有软骨细胞特性。TLR-3和TLR-4对基质蛋白多糖的形成无明显作用,却能够促进II型胶原的形成,其机制可能是TLR-3和-4对Sox-9表达的上调作用。