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鼻咽癌是我国南方地区及东南亚国家高发的恶性肿瘤之一,该类肿瘤的复发及远处转移是导致治疗失败及死亡的重要方式。近年来的研究发现,肿瘤干细胞是导致包括鼻咽癌在内的恶性肿瘤复发和耐药的重要原因,目前已从多种恶性肿瘤中分选出肿瘤干细胞。肿瘤干细胞表现出一定的自身特性,如自我复制能力强,高表达端粒酶活性,具有CD133+、CD44+表面标志物等。这为进一步探讨肿瘤干细胞在肿瘤发生发展及靶向肿瘤干细胞提供了新领域。本课题组曾开展了端粒酶抑制剂PinX1基因靶向鼻咽癌细胞端粒酶活性抑制鼻咽癌细胞的前期研究工作,在此基础上,拟采用PinX1基因靶向鼻咽癌CD133+肿瘤干细胞,探讨其对该肿瘤干细胞端粒酶活性下调、抑制肿瘤干细胞活性,并进一步探讨端粒重复序列结合蛋白(TRF1及TRF2)的调控作用机制,阐明其在PinX1基因作用中的地位。一.CD133+阳性鼻咽癌细胞具有肿瘤干细胞特征目的:观察以CD133+作为干细胞标志物分选CD133阳性细胞的增殖、迁移等能力。方法:鼻咽癌CNE2细胞通过免疫磁珠分选的方法获得CD133+细胞和CD133-细胞,并通过流式细胞术对分选的效率进行验证。然后将获得的CD133+细胞和CD133-细胞进行干细胞球诱导及裸鼠体内成瘤,通过QPCR法检测CD133+细胞和CD133-细胞中干细胞标志物SOX2、Nanog的表达。其次用CCK-8观察两株细胞的生长情况,通过Transwell法和划线法观察细胞迁移情况,通过Transwell法观察细胞侵袭情况。结果:1.以未加任何标记的CNE2细胞系为阴性对照,对常规培养3天的细胞表面的CD133和CD44的表达情况检测发现,CD133+和CD133-细胞成功分选。2.将新分选的CD133+和CD133-细胞,接种到含有bFGF、EGF、胰岛素和B27无血清干细胞诱导培养基中,14天后,CD133+肿瘤细胞球的半径显著大于CD133-细胞。3.通过QPCR检测CD133+和CD133-细胞中的Nanog和SOX2,Nanog和SOX2的mRNA在CD133+细胞中的表达量显著高于CD133-细胞。4.使用CCK-8法考察分选的CD133+和CD133-细胞的生长情况,发现CD133+细胞增殖速度显著快于CD133-细胞。5.通过划线实验或Transwell法检测CD133+和CD133-细胞的迁移和侵袭能力,发现CD133+细胞比CD133-细胞迁移、侵袭能力强。6.该种CD133+鼻咽癌干细胞比CD133-细胞群有较强的裸鼠成瘤能力。结论:采用CD133磁珠从鼻咽癌CNE2细胞中成功分选出CD133+鼻咽癌肿瘤干细胞,同时表达Nanog和SOX2及端粒酶活性,体外成球、增殖、迁移、侵袭能力及裸鼠成瘤等肿瘤干细胞特征明显强于CD133-鼻咽癌细胞群。二.PinX1基因靶向端粒酶抑制CD133+鼻咽癌干细胞目的:探讨PinX1基因对CD133+鼻咽癌干细胞增殖和迁移等活性的影响方法:在CD133+细胞中转染PinX1过表达质粒及相应的空载质粒,在CD133-细胞中转染PinX1 siRNA及NC siRNA,将获得细胞进行干细胞球诱导,用CCK-8观察细胞的生长情况,通过Transwell法和划线法观察细胞迁移情况,通过Transwell法观察细胞侵袭情况,通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:1.PinXl质粒转染CD133+鼻咽癌干细胞后,能明显下调该肿瘤干细胞端粒酶活性,2.CD133+细胞中转染PinX1过表达质粒后,细胞增殖速度低于空载组;CD133-细胞中转染PinX1 siRNA后生长速度高于NC对照组。3.CD133+细胞转染PinX1过表达质粒后,干细胞球半径显著变小,细胞成球能力减弱;而CD133-细胞中转染siRNA后,成球半径略有增加,细胞成球能力略有增强。4.CD133+细胞转染PinX1过表达质粒后,细胞迁移、侵袭比例低于空载组;CD133-细胞转染PinX1 siRNA后,细胞迁移、侵袭比例高于NC组。5.CD133+细胞转染PinX1过表达质粒后,细胞凋亡比例高于空载组;CD133-细胞转染PinX1 siRNA后,细胞凋亡比例低于NC组。结论:PinX1能够通过下调肿瘤干细胞中端粒酶活性抑制CD133+鼻咽癌干细胞的增殖和迁移、增加CD133+细胞的凋亡。三.hTERT及TRFs在PinX1基因作用中的调控机制目的:进一步探讨hTERT及TRFs在PinX1基因作用中调控作用机制方法:我们通过QPCR检测hTERT的表达检测CD133+细胞中端粒酶的活性,并通过QPCR的方法检测PinX1的表达。在CD133+细胞中转染PinX1过表达质粒及相应的空载质粒,在CD133-细胞中转染PinX1 siRNA及NC siRNA,通过QPCR和WB方法观察hTERT、PinX1、TRFs的表达。结果:1.CD133+细胞中PinX1表达量低于CD133-细胞,而hTERT的在CD133+细胞中的表达量显著高于CD133-细胞,表明CD133+细胞端粒酶活性比CD133-强。2.我们成功构建了 PinX1过表达质粒和siRNA,并通过QPCR和WB验证了 PinX1过表达质粒和siRNA在CNE2细胞中的成功影响了 PinX1含量。3.在CD133+细胞中转染PinX1过表达质粒后hTERT表达量低于空载质粒,而TRF1高于空载组,在CD133-细胞中转染PinX1 siRNA,hTERT表达高于NC组,TRF1低于NC组。但TRF2不受影响。结论:PinX1基因下调CD133+鼻咽癌肿瘤干细胞端粒酶活性,同时可上调TRF1表达,抑制该肿瘤干细胞的生物学活性,即PinX1基因可通过hTERT-TRF1发挥对鼻咽癌肿瘤干细胞抑制作用。