苍术病原菌鉴定及其内生真菌抑菌活性研究

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苍术Atractylodes lancea为多年生药用草本植物,以其干燥根茎入药,有益气运脾、燥湿化浊之功效。随着苍术人工栽培面积的不断扩大,田间病害严重已成为制约其种植业发展的主要问题之一。内生真菌广泛存在于健康植物组织内部,其产生的各类活性物质,在农业生产、生物制药和工业发酵等方面都表现出良好应用前景。本研究分别分离纯化同田采集的健康苍术叶片和根茎的内生真菌,以及感病苍术植株感病部位的病原菌,筛选可抑制分离所得苍术病原菌生长并具有广谱抑菌效果的苍术内生真菌,通过形态学观察和分子生物学测定对筛选出的苍术内生真菌、苍术病原菌进行分类鉴定,考察筛选所得苍术内生真菌生物学特性,并对其发酵液稳定性进行测定,对筛选所得苍术内生真菌的有机试剂提取物与苍术组培苗进行培养实验,观察其对本试验分离所得苍术病原菌的防治效果。主要研究结果如下:1.采用组织分离法,分别从健康苍术叶和根部分离出48株苍术内生真菌。其中,40株来自苍术根,8株来自苍术叶;同时从感病苍术叶和根部分别分离出4株和1株苍术病原菌。经苍术内生真菌的回接和苍术病原菌的致病性测定,确定它们分别为苍术内生真菌和病原菌。2.结合分子生物学方法和形态学观察,5株苍术病原菌分别被鉴定为恶苗病菌Fusarium moniliforme、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、炭疽病菌Collectotrichum gloeosporivides、镰刀菌Fusarium sp.和黑附球菌Epicoccum purpurascens。3.通过五点对峙法,从48株苍术内生真菌中初步筛选出5株对多种植物病原菌有较强抑制效果的苍术内生真菌;又通过两点对峙法,从5株苍术内生真菌中复筛出2株抑菌效果最好的苍术内生真菌K24和K29。其中,K24对禾谷镰刀菌Fusarium.graminearum、苹果落叶斑点病菌Alternaria mali、炭疽病菌Collectotrichum gloeosporivides、马铃薯晚疫病菌Fusarium lateritium、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum和黑附球菌Epicoccum purpurascens的拮抗指数均超过70%,K29对草莓灰霉病菌Botrytis cinerea、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum和黑附球菌Epicoccum purpurascens的拮抗指数均超过60%。4.综合实验客观因素等,选择K29为进一步研究对象。结合分子生物学方法和形态学观察,鉴定苍术内生真菌K29为砖红镰刀菌Fusarium brassica。对K29砖红镰刀菌生物学特性进行了测定,结果显示p H、温度、碳源和氮源分别为7、25℃、蔗糖和硝酸钾时,5d后测得菌落生长直径最大分别可以为82mm、70mm、68mm、70mm。对其发酵液热稳定性和酸碱稳定性进行研究。结果表明,K29发酵液经25℃处理后的抑菌率最高,达到58.64±0.36(%);随着处理温度的提高,抑菌率逐渐下降;p H为5时抑菌效果最好,达到55.72±0.56(%),过酸或过碱抑菌效果下降。5.利用K29砖红镰刀菌Fusarium brassica的三种有机试剂(石油醚、乙酸乙酯和正丁醇)提取物,分别探讨其各自对苍术组培苗的影响,结果发现其乙酸乙酯提取物对苍术组培苗有促生作用,株高可达5.51±0.53cm,鲜重达2.23±0.51g,新根数和分蘖数分别达5.2根和4.3株,与对照存在显著差异。石油醚和正丁醇提取物与对照相比无明显促生作用。分别利用K29上述三种有机试剂提取物进行抑菌试验,结果发现其乙酸乙酯提取物对苍术病原菌的抑菌效果最好,对恶苗病菌Fusarium moniliforme拮抗指数最高,可达65.68±0.53%。
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