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目的:通过16Sr DNA高通量测序技术对胆道菌群进行测序分析,探明与胆囊结石形成相关的主要菌群以及大黄灵仙方调节的主要菌群,初步探究大黄灵仙方对胆道菌群的影响;进一步对胆道菌群与胆汁指标进行关联性分析,联合TLR4/My D88/NF-κB信号通路,探讨大黄灵仙方调节胆道微生态与胆囊结石形成的可能机制。方法:（1）将50只体重为250±10g的雄性豚鼠随机分为正常组、模型组、中药组,其中正常组和中药组各15只,模型组20只;采用高脂致石饲料复制胆囊结石豚鼠模型,造模同时中药组予大黄灵仙方灌胃给药,其余两组予生理盐水灌胃,连续干预8周后,采集豚鼠血清、胆汁、胆囊组织和肝脏组织样本,计算各组豚鼠胆囊结石成石率,记录豚鼠一般情况及体重变化,HE染色检测胆囊组织和肝脏组织的病理形态变化,采用16Sr DNA检测胆道菌群的变化;（2）ELISA检测豚鼠血清及胆汁中总胆固醇、总胆汁酸、IL-6、TNF-a、LPS含量的变化,采用Pearson统计学方法检测胆道菌群与胆汁总胆固醇、总胆汁酸、LPS、IL-6、TNF-a的相关性,采用q-PCR、Western Blot检测胆囊组织TLR4、My D88、NF-κBp65表达,采用免疫组化法检测TLR4、My D88、NF-κBp65、IL-6在胆囊组织中的定位及表达。结果:（1）豚鼠一般情况及体重变化:模型组豚鼠毛色萎黄,毛发脱落严重,饮食减少,便质软呈深褐色,部分豚鼠出现便溏,为稀白样便,活动缓慢,喜蜷缩,精神萎靡;与模型组相比,中药组上述症状较轻。造模第8周,各组豚鼠体重均增加,与模型组相比,中药组豚鼠体重有降低趋势,但无统计学差异（P＞0.05）。正常组豚鼠成石率为8.3%,模型组成石率为90.8%,中药组成石率为36.4%;（2）HE染色结果显示:与正常组相比,模型组豚鼠肝脏出现脂肪样变,伴有血管周围炎性病变,胆囊黏膜增厚,柱状上皮细胞排列紊乱,炎症细胞大量浸润;中药组豚鼠肝脏中脂肪样变减轻,胆囊黏膜柱状上皮细胞排列整齐,黏膜无明显增厚,部分炎症细胞浸润;（3）胆道菌群结构组成:从门分类水平上分析,胆道菌群主要由变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteria）组成,其中变形菌门（Proteobacteria）是胆道菌群的绝对优势菌,约占97%以上。从属水平上分析,胆道菌群主要由伯克霍尔德菌属（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）、鞘脂菌属（Sphingopyxis）、短波单胞菌属（Brevunmdimonas）、戴尔福特菌（Delftia）、假单胞菌属（Pseudomonas）组成,构成比在90%以上;（4）胆道菌群差异分析结果显示:与正常组相比,模型组菌群丰富度降低,OTU数目减少,栖热菌门（Deinococcus-Thermus）、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）、芽单胞菌属（Blastomonas）、柄杆菌属（Caulobacteraceae＿unclassified）、Denitratisoma、梭菌属（Clostridium＿sensu＿stricto＿8）、氢噬胞菌属（Hydrogenophaga）丰度增加（P＜0.05）,疣微菌门（Verrucomicrobia）、毛螺菌属（Muribaculaceae＿unclassified）、申氏杆菌属（Shinella）、阿克曼氏菌属（Akkermansia）丰度减少（P＜0.05）;与模型组相比,中药组菌群丰富度上升,OTU数目增加,厚壁菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）丰度显著升高（P＜0.05）,短波单胞菌属（Brevundimonas）、Thermincola、苯基杆菌属（Phenylobacterium）、产卟啉杆菌属（Porphyrobacter）,红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）、鞘脂菌属（Sphingobium）、志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）、罕见小球菌属（Subdoligranulum）、Agathobacter、普拉梭菌属（Faecalibacterium）丰度降低（P＜0.05）;（5）ELISA结果显示:与正常组相比,模型组豚鼠胆汁和血清中T-CHO、LPS、IL-6、TNF-a含量显著升高（P＜0.01）,而胆汁和血清中TBA含量显著降低（P＜0.01）;与模型组相比,中药组豚鼠胆汁及血清中LPS、IL-6表达量均显著降低（P＜0.01）,血清中T-CHO及TNF-a含量显著降低（P＜0.01）,TBA含量明显升高（P＜0.05）,而胆汁中T-CHO和TNF-a含量有降低趋势,TBA含量有升高趋势,但均无统计学差异（P＞0.05）;（6）胆道菌群与胆汁检测指标的相关性分析:在门水平上,胆道菌群与胆汁总胆固醇、总胆汁酸、LPS、IL-6、TNF-a不存在相关性。在属水平上,总胆固醇与Methyloversatilis的丰度呈负相关（P＜0.05）,总胆汁酸与伯克霍尔德菌（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）的丰度呈正相关（P＜0.05）,与红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）、根瘤菌属（Bradyrhizobiu）、Phreatobacter的丰度呈负相关（P＜0.01）,其中根瘤菌属（Bradyrhizobium）的丰度与总胆汁酸的表达量的相关性极显著;LPS与红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）的丰度呈正相关（P＜0.01）;（7）q-PCR及WB检测结果显示:与正常组相比,模型组豚鼠胆囊组织中TLR4、Myd88、NF-κBp65m RNA及蛋白表达量均显著升高（P＜0.01）;与模型组相比,中药组豚鼠胆囊组织TLR4、NF-κBp65m RNA及蛋白表达量均显著降低（P＜0.01）;其中My D88m RNA显著降低（P＜0.01）而My D88蛋白有降低趋势但无统计学差异（P＞0.05）。（8）免疫组化检测结果显示:与正常组相比,模型组TLR4、My D88、NF-κBp65明显表达于胆囊黏膜层和肌层。经平均光密度值检测,各蛋白表达趋势与q-PCR及WB检测结果基本一致。与正常组相比,模型组IL-6表达量显著升高,而中药干预后IL-6表达量显著降低（P＜0.01）。结论:（1）胆囊结石形成的过程中胆道菌群处于紊乱状态,大黄灵仙方能够调节胆道菌群的丰度结构趋向正常状态;（2）胆道菌群可能通过调控胆固醇-胆汁酸的代谢及LPS的释放影响结石形成,其中红假单胞菌属在胆囊结石形成的过程中可能发挥较为重要作用;（3）大黄灵仙方改善胆道微生态的同时可显著降低TLR4/My D88/NF-κB信号通路关键蛋白的表达,提示大黄灵仙方的作用机制可能是通过调节胆道菌群,减少LPS含量,抑制TLR4/My D88/NF-κB信号通路,改善胆囊炎症状态从而影响胆囊结石的形成。